FOXC2对人食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及相关机制研究*

蒋琳，廖君左，赵妍丽，商义，沈俊

637000四川 南充，川北医学院第二附属医院 内科(蒋琳、商义)，普外科(沈俊)；637000四川 南充，川北医学院附属医院 小儿外科(廖君左)，肿瘤科(赵妍丽)

食管癌是世界上第6大癌症死亡原因和第8大常见癌症，5年生存率约为15 %～25 %，我国是食管癌最主要的高发地区之一，大多数患者在确诊时已经处于中晚期，耽误了最佳的治疗时机[1]。探讨食管癌的发病机制，寻找有效的靶基因对治疗食管癌具有重要意义。叉头框C2(fork head box C2,FOXC2)是一种转录因子，在胚胎发育中起到重要作用，并且FOX基因的突变或失调常常与疾病有关，包括癌症[2]。FOX蛋白FOXM1在胶质瘤和胰腺癌细胞中表达，通过调节血管内皮生长因子的表达可促进血管生成[3]。叉头框转录因子O(forkhead box O，FOXO)是FOX蛋白家族中的一个重要的亚家族，包括FOXO1、FOXO3a、FOXO 4、FOXO6，研究显示FOXO1/3a/4在前列腺癌和白血病中起着肿瘤抑制因子的作用[4]。证据表明FOXC2是肿瘤发生和疾病进展的关键因素，在结肠癌、大肠癌中均表达上调，并与癌症的预后、转移有关，在肿瘤细胞迁移、侵袭、上皮细胞间充质化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等过程中均具有调控作用[5]。然而，FOXC2对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及相关机制研究尚不清晰。因此，本研究旨在探讨FOXC2对食管癌细胞的影响，明确FOXC2在食管癌细胞转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人食管癌细胞系(CaES-17，Eca-109和TE13)和人食管上皮细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；USA)，将细胞在含有10%胎牛血清(FBS；Gibco，USA)和1%(v/v)青霉素-链霉素(SigmaAldrich，USA)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM；Gibco，USA)中进行培养，所有细胞在37℃，5% CO2条件孵育。

1.2 细胞转染

人FOXC2全长基因序列设计的小干扰RNA(siRNA)及纯化FOXC2 cDNA构建pcDNA-FOXC2重组质粒由上海吉玛生物技术有限公司设计，其碱基序列为5’-GACCCAACCAGACAAUUAATT-3’。转染前24 h，胰蛋白酶消化细胞，按每孔4×104个细胞接种于12孔板。待细胞生长至30%～50%时采用Lipofectamine2000进行转染。每孔取siRNA或pcDNA 50 nmol/L与脂质体2 μL分别溶于100 μL无血清的DMEM培养基中，并在5 min内将以上两种液体轻轻混匀，室温下静置20 min。在每孔中加入DMEM完全培养基1 mL，再将以上混合物滴加至每孔中，轻轻摇匀，将细胞置于37℃培养过夜。设置未转染组(control)和转染空载体干扰组用于对照(negative control)，转染72 h后用于后续实验。

1.3 实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测

使用TRIzol试剂盒(Invitgen，USA)按照制造商说明从食管癌细胞中提取总RNA。每个样品的总RNA约5 μg被逆转录成第一链cDNA用于qRT-PCR分析。使用SYBR PreMix Taq在ABI PRISM 7900热循环器(Applied Biosciences，USA)上进行PCR扩增。引物序列：FOXC2：5’-CCGAGAAGAAGATCACCTTGAA-3’(正向)，5’-GA CACGTCCTTCTTTTTGAAGC-3’(反向)，GADPH：5’-ATCCCATCACCATCTTCCCAG-3’(正向)，5’-CCAT CACGCCAGTTTTCC-3’(反向)。以GAPDH内参。qRT-PCR反应条件：95℃初始变性10 min，随后95℃变性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，45个循环，记录CT值，采用2-ΔΔCT分析相对表达水平。

1.4 Western blot检测

收集细胞用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤3次，然后在RIPA裂解液(Cell Signal Technology，USA)中用蛋白酶和磷酸酶抑制剂在冰上溶解10 min，蛋白质浓度用Bio-Rad蛋白质测定法(Hercules，USA)测定，等量的蛋白质样品用12% SDS-PAGE分离，并转移到聚偏二氟化膜(Milliperes，USA)上，然后用5%脱脂牛奶封闭1h。随后用一抗FOXC2(稀释比：1∶1000，货号：sc-515472，Santa Cruz)、MMP2(稀释比：1∶1000，货号：sc-13595，Santa Cruz)、MMP9(稀释比：1∶1000，货号：sc-393859，Santa Cruz)、E-钙黏附素(E-cadherin)(稀释比：1∶1000，货号：sc-8426，Santa Cruz)、N-钙黏附素(N-cadherin)(稀释比：1∶1000，货号：sc-59987，Santa Cruz)、Vimentin(稀释比：1∶1000，货号：sc-6260，Santa Cruz)、Snail(稀释比：1∶1000，货号：3879S，Santa Cruz)、Wnt3a(稀释比：1∶1000，货号：sc-136163，Santa Cruz)、β-catenin(稀释比：1∶1000，货号：sc-7963，Santa Cruz)、p-β-catenin(稀释比：1∶1000，货号：sc-57535，Santa Cruz)和β-catin(稀释比：1∶2000；货号：sc-47778，Santa Cruz)4℃孵育过夜，随后与辣根过氧化物酶偶联的二级抗体孵育(1∶3000；Santa Cruz),室温孵育1 h。ECL暗室显色，显色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin为内参，对照组目标蛋白质相对含量为1，计算各组蛋白质的相对表达量，实验重复3次。实验根据western blot检测FOXC2表达结果，选择FOXC2相对高表达食管癌细胞(本实验是CaES-17细胞)进行细胞转染及后续实验。

1.5 细胞增殖实验(CCK-8)

使用细胞CCK-8试剂盒说明(Beyotime Technology，江苏)评估细胞增殖。将转染的CaES-17细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)中，在37℃培养箱中培养24 h，培养结束前每孔加入10 μL CCK-8试剂后继续培养3 h，肉眼观察细胞孔中颜色由黄色变成深橙色，通过酶标仪(Bio-Rad)在450 nm处测定吸光度。

1.6 细胞划痕实验

细胞接种于6孔板，恒温细胞培养箱中培养，用10 μL无菌枪头在6孔板底部轻划一条角度一致、粗细均匀的直线(每组设3个重复，每组实验重复3次)。分别于0、48 h在倒置相差显微镜下观察同一视野划痕的宽度并拍照。

1.7 细胞侵袭实验

将转染的CaES-17细胞经胰蛋白酶消化后，用不含血清的细胞培养液把细胞浓度调整为1×104个/mL，在实验前3 h，取基质胶加入到Transwell小室中，于37℃孵育湿化3 h，待基质胶凝固后，在小室中加入不含胎牛血清的细胞培养液继续孵育40 min，取适量的细胞悬浮液加入Transwell小室中，放在24孔板中，小室外侧加入细胞培养液，37℃孵育48 h后，用PBS洗涤Transwell小室，把没有穿膜的细胞用棉签擦掉，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色30 min，随机选取每孔6个视野，并通过显微镜(Olympus，Japan)观察侵袭细胞数。

1.8 统计分析

2 结 果

2.1 FOXC2在食管癌细胞中的表达

检测结果显示，FOXC2在人食管癌细胞CaES-17、Eca-109、TE-13中的表达明显高于人食管上皮细胞(P<0.05)，其中人食管癌细胞CaES-17中FOXC2表达相对较高(图1)。

图1 FOXC2在食管癌细胞中的表达(** P<0.01，* P<0.05)

2.2 FOXC2对食管癌细胞生物学行为的影响

Western blot检测结果显示si-FOXC2组的FOXC2表达明显低于对照组，pcDNA- FOXC2组的FOXC2表达明显高于对照组(P<0.05)(图2A)；qRT-PCR检测结果显示si-FOXC2组的FOXC2 mRNA表达明显低于对照组，pcDNA-FOXC2组的FOXC2 mRNA表达明显高于对照组(P<0.05)(图2B)；CCK-8检测细胞增殖结果显示si-FOXC2组细胞增殖较对照组明显降低(P<0.01)，pcDNA-FOXC2组细胞增殖增加，但差异无统计学意义(P>0.05)(图2C)；细胞划痕实验结果显示与0 h相比较，pcDNA-FOXC2组48 h后细胞划痕愈合能力明显增强，相对宽度较对照组窄(图2D)；Transwell细胞侵袭实验显示，与对照组比较，si-FOXC2组穿过基膜的细胞数明显降低(图2E、F)；Western blot检测迁移及EMT相关蛋白显示，与对照组相比，pcDNA- FOXC2组的MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimentin、Snail表达均升高，但仅MMP9、Snail差异具有统计学意义(P<0.05)，E-cadherin表达降低，较对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图2G)。

图2 FOXC2对食管癌细胞生物学行为的影响(**P<0.01，*P<0.05)

2.3 FOXC2对食管癌细胞Wnt/β-catenin通路的影响

检测结果显示si-FOXC2组Wnt3a表达较对照组明显降低(P<0.05)，β-catenin、p-β-catenin较对照组表达降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；pcDNA-FOXC2组Wnt3a、β-catenin、p-β-catenin表达均升高，较对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

图3 食管癌细胞Wnt/β-catenin通路相关因子表达(**P<0.01，*P<0.05)

3 讨 论

近年来，化疗加放疗越来越多地被作为常规手术切除食管癌的补充或辅助治疗手段，使早期食管癌的临床结果逐渐改善。然而，在晚期病例中，即使食管癌没有转移，其预后仍然很差，癌细胞直接侵袭邻近的重要器官或淋巴结转移是食管癌根治性切除的严重障碍之一，也提高了食管癌局部复发率[6-7]。虽然已经发现多种分子与食管癌的转移相关，但是其特异性及敏感性不能满足对食管癌诊断和治疗的要求，因此，迫切需要研究食管癌转移的分子机制。

FOXC2属人类forkhead家族，是由人类染色体16q24.3区编码的一种转录因子，其编码的蛋白共有494个氨基酸残基，具有显著的forkhead结构域。研究报道其与血管淋巴管的形成、肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗以及Ⅱ型糖尿病等密切相关[8-9]。研究证实，宫颈癌中FOXC2高表达并与肿瘤的增殖及转移能力有关[10]。乳腺癌中FOXC2通过血小板衍生生长因子受体的表达影响EMT[11]。Cui等[12]证实结直肠癌中FOXC2高表达并通过激活MAPK和AKT通路促进肿瘤增殖。Agnihotri等[13]报道口腔鳞状细胞癌中FOXC2可促进肿瘤血管形成。胃癌中FOXC2高表达且对患者预后有影响[14]。而关于FOXC2对食管癌的作用机制目前尚不清晰。本实验检测FOXC2在食管癌细胞中的表达结果表明，人食管癌细胞FOXC2的表达较人食管上皮细胞明显升高(P<0.05)，提示其可能与食管癌相关，可能是食管癌进展的关键分子。

研究证实EMT在肿瘤发展中具有尤为重要的作用，其通过增强癌细胞的侵袭性和迁移来促进肿瘤的进展，是肿瘤发生过程中促进侵袭和转移的主要分子机制之一。在EMT过程中，多种作用于EMT诱导因子的下游分子如E-cadherin、整合素和MMPs已被确定为食管癌恶性潜能的指标[15-16]。这些发现表明EMT调控基因可能在食管癌的侵袭和转移中起关键作用。研究报道，FOXC2可特异性地促进间充质分化[17]。此外，研究表明FOXC2的表达与高度侵袭性的基底样乳腺癌显著相关，并且FOXC2的过度表达增加了小鼠乳腺癌细胞向肺的转移潜能[18]。FOXC2可以允许癌细胞获得更好的侵袭和转移环境，而由于食道缺乏浆膜，癌细胞直接侵入附近气管、胸膜或心包等结构从而可能导致预后不良[19]。本实验结果表明，低表达FOXC2可使食管癌细胞增殖及侵袭能力明显降低(P<0.01)。表明FOXC2的低表达与食管癌细胞迁移和侵袭性相关，在肿瘤转移过程中发挥抑制作用。

FOXC2是EMT的重要调节因子，EMT是肿瘤进展和转移过程中经常激活的关键过程。研究表明，FOXC2可通过激活多种EMT转录因子促进乳腺癌细胞的浸润和转移，其中包括Snail、Twist、Goosecoid等[20];并且FOXC2过度表达促进间充质分化，以及诱导MMP2、MMP9表达，MMP2和MMP9是降解IV型胶原的酶，IV型胶原是基底膜的主要成分，与人类肿瘤的侵袭潜力和血管化有关[21]。此外，FOXC2间接抑制上皮标记物E-cadherin的表达，其缺失被认为是EMT的标志，并直接下调p120catenin；p120catenin是一种在上皮细胞的粘附连接处稳定E-cadherin的调节蛋白[22]。因此，积累的证据表明，EMT诱导的信号分子，刺激癌细胞中FOXC2的表达以及其他EMT促进转录因子的表达，并介导间充质分化，从而导致EMT和转移。由此可见，EMT在恶性肿瘤的侵袭转移过程中发挥着关键的作用。本实验结果表明高表达FOXC2可促进MMP2、MMP9的表达，但仅MMP9表达较对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。提示FOXC2可能通过MMP9修饰细胞外基质，参与局部侵袭；此外，高表达FOXC2可使N-cadherin、Vimentin、Snail表达升高，E-cadherin表达降低，但仅Snail表达较对照组差异具有统计学意义(P<0.05)。提示下调FOXC2可能通过作用于Snail影响食管癌细胞侵袭过程，FOXC2可能是EMT的关键介质。

食管癌等恶性肿瘤的发生发展与抑癌基因的下调或失活、癌基因表达的上调或激活、致癌信号通路的激活以及抑癌信号通路的失活密切相关[23]。Wnt/β-catenin信号通路是最经典的致癌信号通路之一，Wnt/β-catenin信号通路的过度激活通常伴随着诸如食管癌等恶性肿瘤的发展[24]。尽管Wnt/β-catenin信号通路对于胚胎是必不可少的，然而，当Wnt/β-catenin信号通路过度激活时，与细胞增殖和迁移相关的靶基因表达上调，这促进了细胞的增殖和迁移，导致细胞的恶性转化[25]。研究表明淋巴管内皮细胞中Wnt/β-catenin信号传导可诱导淋巴水肿相关转录因子FOXC2的表达，此外，转录因子PROX1与β-catenin和Tcf/lef转录因子TCF7L1形成复合物，以增强Wnt/βcatenin信号转导并促进FOXC2的表达[26]。本实验研究表明FOXC2低表达可明显降低Wnt3a表达，β-catenin、p-β-catenin表达较对照组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。提示FOXC2可能抑制食管癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活性。

综上所述，本研究发现FOXC2在人食管癌细胞中表达较高，沉默FOXC2明显抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，FOXC2的低表达下调了食管癌细胞中Wnt/βcatenin通路相关因子Wnt3a的表达，FOXC2可能是食管癌中有意义的预后标记物。

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