PD1多态性与晚期非小细胞肺癌铂类化疗敏感性及骨髓抑制的关系*

赵万，奉林，余玲玲，许丽华，程文秀

215153 江苏 苏州，南京医科大学附属苏州科技城医院 肿瘤科

肺癌是全世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅16%[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌总数的85%，并且新发病例中约2/3是晚期患者，化疗是治疗晚期NSCLC的主要方法[2]。目前临床上NSCLC常用的化疗是以铂类为基础的两药联合治疗方案，总体药物反应率仅30%～40%，肿瘤耐药是化疗失败的主要原因。

铂类药物主要作用靶点在DNA，损伤DNA的功能，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，对于铂类耐药的肿瘤细胞，通过诱导凋亡能够有效逆转细胞的耐药性[3-4]。另外，多项研究发现免疫治疗联合化疗的效果优于单用化疗[5-7]。这些研究通过正向调节免疫功能增强了化疗效果，提示机体的不同免疫状态能够影响患者的化疗反应性。程序性细胞死亡受体1(programmed cell death 1，PD1)是一种表达在活化的T细胞、B细胞和髓系细胞的免疫抑制受体。PD1与配体PD-L1结合后可下调细胞因子的分泌，导致T细胞增殖抑制、凋亡、失活，而阻断PD1信号能够使CD8+T细胞激活，恢复细胞毒性能力，从而影响机体免疫状态[8]。张丽萍等[9]对子宫内膜癌的研究发现，PD1高表达与患者总生存期延长相关。此外，PD1过表达还能促进凋亡，进而增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性[10]。因此，PD1单核苷酸多态性可能造成不同个体间PD1基因表达差异，改变PD1受体的结构或功能，调节机体免疫状态，导致疾病的发生、发展，影响化疗反应性。已有研究发现PD1单核苷酸多态性与食管癌[11]、基底细胞癌[12]、乳腺癌[13]的发病存在密切关联，但国内外尚未见PD1多态性与肿瘤化疗疗效相关研究报道。

本研究对103例采用含铂方案化疗的晚期NSCLC患者的近期疗效及化疗后骨髓抑制进行了评价，并对PD1基因rs36084323A/G、rs2227982C/T多态性位点进行基因型分析，探讨PD1基因多态性与铂类药物化疗敏感性及骨髓抑制之间的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

从2016年5月至2019年3月苏州科技城医院肿瘤科住院患者中收集103例初治晚期NSCLC 患者，所有患者均经组织病理学检查确诊。患者年龄30～78岁，平均年龄(56.82±6.08)岁，均为汉族。纳入标准：1)东部肿瘤协作组评分≤2分，心电图无异常，肝肾功能在正常值范围，骨髓功能正常(白细胞≥4.0×109/L，中性粒细胞计数≥2.0×109/L，血小板计数≥100×109/L，血红蛋白≥100 g/L)；2)需经组织病理学确诊；3)CT扫描证实具有可测量评价的肿瘤病灶。排除标准：1)存在第二原发肿瘤；2)既往曾接受过任何形式的抗肿瘤治疗，如手术、化疗、放疗等。所有受试者均在完全自愿的基础上参与本研究，并签订知情同意书，本研究经苏州科技城医院伦理委员会批准。

1.2 化疗方案、临床疗效评估、毒副反应评价

103例患者均接受以顺铂(cisplatin, DDP)或卡铂(carboplatin,CBP)为基础的化疗方案。63例(61.2%)接受DDP/CBP加培美曲塞 (pemetrexed,PEM)，22例(21.3%) 接受DDP/CBP加紫杉醇(paclitaxel, TAX)，18例(17.5%)接受DDP/CBP加吉西他滨(gemcitabine,GEM)治疗。化疗剂量为:PEM 500 mg/m2，第1天；TAX 135～175 mg/m2，第1天；GEM 1 250 mg/m2，第1、8天；DDP 75 mg/m2，第1天，或CBP取AUC曲线下面积等于5～6，第1天。所有患者均为初治，每3周为1个化疗周期，每化疗2个周期后根据RECIST1.1实体瘤疗效评定标准[14]进行疗效评价，分为完全缓解(complete response，CR)、部分缓解(partial response，PR)、稳定(stable disease，SD) 和进展(progressive disease，PD)。其中CR、PR 判定为对铂类化疗敏感；如为SD或PD，则对铂类化疗不敏感。按WHO化疗毒副反应分级[15]将化疗后骨髓抑制分为0～Ⅳ度，比较Ⅲ、Ⅳ度骨髓抑制的发生率在不同基因型患者中的差异。

1.3 DNA 提取和基因型分析

所有103例患者均于首次化疗前抽取静脉血5 mL ，置于抗凝管中，于-20℃下冷冻保存。用DNA快速提纯试剂盒(美国Promega生物试剂公司)提取外周血DNA，并检测总的DNA浓度、纯度和完整性，显示样本浓度适中，适合进行多重PCR扩增。采用RT-PCR法对所有受试对象行PD1基因多态位点的基因型检测，每个PCR反应体系含1 μL(300 ng)基因组DNA，0.45 μL氯化镁(50 mM)，0.3 μL引物，1.5 μL PCR缓冲液(10×)，0.45 μL dNTP(10 mM)，1 μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)和10.9 μL无核酸酶水。循环中的温度和时间参数如下：最初在95℃预变性5 min，紧接 94℃变性30 s，而后64℃退火30 s，进而72℃延伸30 s，共计行35个循环，最后在72℃下延伸5 min。PCR产物3 μL、引物1 μL，与11 μL缓冲液混合，获得25 μL总体系，在2%琼脂糖凝胶上电泳，在95℃变性3 min后立即冰水浴，获得终产物，按照ABI3100型测序仪的说明书对PD1多态性进行测序，确定基因型。随机抽取20%样本，双盲法重复检测加以验证，结果完全一致。各基因位点引物如下，rs36084323上游引物：5，-GCCATCCACAAGGTGGAAGCT，下游引物：5，-CTCAACCCCACTCCCATTCTG；rs2227982上游引物：5，-GGACAGCTCAGGGTAAGCAG，下游引物：5，-GCATACTCCGTCTGCTCAGG。

1.4 统计学处理

采用SPSS 23.0软件统计，用拟合优度χ2检验各位点基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡。以χ2检验或 Fisher精确概率法比较不同基因型对化疗敏感性、骨髓抑制的影响。以比值比(odds ratios,OR)及95%可信区间(confidence intervals,CI)表示各基因型与治疗效果、骨髓抑制的关系。OR值及95%CI以非条件Logistic回归模型计算，并经患者年龄、性别、吸烟、组织类型、分化程度等校正。P<0.05表示差异有统计学意义，统计检验均为双侧概率检验。

2 结 果

2.1 化疗效果及化疗后骨髓抑制

103例晚期NSCLC患者化疗后，2例(1.9%)CR，37例(35.9%)PR，28例(27.3%)SD，36例(34.9%)PD。总体临床化疗有效率(CR+PR)37.8%。化疗后出现0度骨髓抑制2例(1.9%)，Ⅰ度骨髓抑制40例(38.8%)，Ⅱ度骨髓抑制33例(32.0%)，Ⅲ度骨髓抑制19例(18.4%)，Ⅳ度骨髓抑制9例(8.7%)，其中Ⅲ度及Ⅳ度骨髓抑制累计28例(27.1%)。DDP/CBP联合PEM、DDP/CBP联合TAX、DDP/CBP联合GEM化疗后出现Ⅲ、Ⅳ度骨髓抑制分别有16例(25.4%)、7例(31.8%)、5例(27.8%)，组间比较差异无统计学意义(χ2=0.337，P=0.845)；不同性别、年龄、病理类型、分化程度、吸烟状态、化疗方案与化疗有效率之间无显著性关联(P>0.05)。患者临床特征及其与化疗反应关系详情见表1。

2.2 基因型分布

rs36084323及rs2227982多态性在所有受试者(103例)中均能被明确行基因分型，rs36084323AA、AG、GG基因型分别为41(39.8%)、40(38.8%)及22(21.4%)例；rs2227982CC、CT、TT基因型分别为45(43.6%)、41(39.8%)及17(16.6%)例。 以上2个多态性位点各基因型分布均符合群体遗传学Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.3 基因多态性与化疗敏感性

rs36084323AA、AG、GG基因型患者化疗有效率分别为16/41(39.0%)、15/40(37.5%)及8/22(36.3%)，该多态性位点不同基因型的化疗有效率之间差异无统计学意义(P>0.05)。

rs2227982CC、CT、TT基因型患者化疗有效率分别为9/45(20.0%)、19/41(46.3%)、11/17(64.7%)，CT基因型化疗有效率为CC基因型的2.32倍(95%CI:1.185～4.532,χ2=6.779,P=0.009)；TT基因型化疗有效率为CC基因型的3.23倍(95%CI:1.636～6.397,χ2=11.28,P=0.001)；至少携带一个T等位基因的患者(CT+TT基因型)化疗有效率是CC型的2.58倍(95%CI:1.370～4.880,χ2=10.84,P=0.001)。各位点基因型与化疗反应关系、OR值及95%CI见表2。

表1 患者临床特征与化疗反应的关系

表2 各位点基因型分布及与化疗反应的相关性

2.4 基因多态性与化疗后骨髓抑制

rs36084323AA、AG、GG基因型患者化疗后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率分别为5/41(12.2%)、14/40(35.0%)及9/22(40.9%)，AG基因型Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率为AA基因型的2.87倍(95%CI:1.140～7.227,χ2=5.783,P=0.019)；GG基因型Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率为AA基因型的3.35倍 (95%CI: 1.281～8.785,χ2=6.570,P=0.013)；至少携带一个G等位基因的患者(AG+GG基因型)Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率是AA型的3.04倍(95%CI:1.258～7.356,χ2=7.625,P=0.006)。

rs2227982CC、CT、TT基因型患者化疗后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率分别为12/45(26.6%)、10/41(24.3%)及6/17(35.3%)，该多态性位点不同基因型患者的Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率差异无统计学意义(P>0.05)。各位点基因型与化疗后骨髓抑制关系、OR值及95%CI见表3。

表3 各位点基因型分布及与骨髓抑制的相关性

3 讨 论

目前临床上治疗晚期NSCLC的化疗方案仍然是以铂类药物为基础的，例如DDP或CBP联合PEM、TAX、GEM等。然而，相同治疗方案的化疗效果却因人而异，提示不同个体之间存在遗传异质性，导致个体间化疗敏感性的差异，因此，根据患者的遗传学特征选择合理的个体化治疗方案是肿瘤治疗的热点[16]。已有研究证实促进凋亡可逆转肿瘤细胞化疗耐药性[3-4]，而机体免疫状态的改变同样会影响化疗反应性及临床预后[5]。因而，免疫调节通路、凋亡信号传导途径基因多态性可能与铂类化疗的疗效之间存在关联。

PD1基因位于人类染色体2q37.3，基因编码产物PD1是免疫球蛋白受体超家族成员，PD1有两个配体PD-L1及PD-L2，其中PD-L1是主要配体，广泛表达于活化的T、B细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞[17]。PD1与PD-L1结合后引起PI3K/蛋白激酶B(Akt)及RAS通路去磷酸化，抑制T细胞活性、诱导凋亡，并促使CD4+T细胞分化为调节性T细胞，对免疫应答进行负向调控，导致肿瘤免疫逃逸的发生[18]。钟根深等[6]研究奥沙利铂对小鼠结肠癌的治疗效果，在联合PD1抗体治疗后，抗肿瘤活性较单用奥沙利铂明显提升，且发现CD8+T细胞在奥沙利铂的抗肿瘤活性中发挥重要作用。在另一项动物试验中，研究也发现PD1抗体与紫杉醇联合治疗能显著增强小鼠乳腺癌的化疗效果[7]。同样，针对晚期NSCLC一线治疗的KEYNOTE-189研究也显示，与PEM加DDP/CBP化疗组相比，PD1单抗联合化疗能明显提升治疗反应率(47.6%vs18.9%，P<0.001)，并延长了患者的无进展生存期及总生存期[5]。Gadgeel等[19]与Landre等[20]也发现在化疗的同时进行免疫检查点阻断，能明显增强肺癌化疗疗效。此外，Li等[10]研究发现PD1过表达能促进凋亡，增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性，进而抑制卵巢癌细胞的增殖。以上体内外动物实验及临床研究均提示PD1及其配体所介导的信号通路发生异常时，会改变机体的免疫状态，影响细胞凋亡，进而改变化疗的反应性。因此，我们推测PD1基因多态性可能通过调节基因表达、改变PD1受体的结构或功能，导致个体间化疗敏感性的差异。

rs2227982C/T多态性位于PD1基因外显子5，属于非同义cSNP(Val215Ala)，编码氨基酸位于PD1受体胞内区，包括免疫受体酪氨酸抑制物基序和免疫受体酪氨酸开关基序，可能影响信号转导，进而改变PD1在免疫调节通路中的作用[21]。Tang等[22]研究了rs2227982多态性与胃贲门癌的相关性，相较于CC基因型，TT或TT+CT基因型增加了胃贲门癌的发病风险。同样，另一研究也发现rs2227982多态性CT基因型增加了女性罹患食管鳞状细胞癌(easophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的风险，而携带CT基因型且伴吸烟史的食管癌患者预后较好[11]。然而，至今尚未见PD1多态性位点与化疗反应性之间的研究报道。本研究发现PD1rs2227982C/T多态性与晚期NSCLC铂类化疗敏感性存在密切相关，随着等位基因T数目的增加，患者的化疗有效率逐渐升高(CC：20.0%、CT：46.3%、 TT：64.7%)。至少携带一个等位基因T的患者化疗反应率为CC型的2.58倍(95%CI:1.370～4.880，P=0.001)。我们推测rs2227982多态性所致核苷酸C-T突变引起编码的缬氨酸(Val)-丙氨酸(Ala)转换可能影响了PD1分子结构、功能，抑制了PD1的负向免疫调控作用，激活T细胞，减少肿瘤细胞的免疫逃逸，从而使患者对铂类化疗具有更好的反应性。此外，我们研究了rs2227982C/T多态性与化疗后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率之间的关系，但二者间未见明显的相关性(P>0.05)。

PD1另外一个常见的多态性位点rs36084323A/G，位于基因启动子区，涉及UCE-2转录调控子的结合位点，G等位基因携带者具有更高的启动子活性，预示着T淋巴细胞的活力下降和增殖抑制，导致清除病毒和癌细胞的能力较差，但机体免疫耐受性较好[23]。该多态性位点与肿瘤的相关性研究很少，Hua等[13]研究结果显示rs36084323GG基因型能降低乳腺癌的发病风险，而另一研究发现AG基因型能降低有上消化道癌家族史ESCC患者的死亡风险(HR=0.339，95%CI:0.115～0.996)[11]。

本研究探讨了rs36084323A/G多态性与晚期NSCLC化疗临床反应之间的关系，未发现不同基因型患者之间存在统计学差异(P>0.05)。但是，我们发现该多态性与化疗后Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制之间存在密切关联，随着等位基因G数目的增加，患者Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率逐渐升高(AA：12.2%、AG：35.0%、 GG：40.9%)。至少携带一个G等位基因的患者(AG+GG基因型)Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制发生率是AA型的3.04倍(95%CI:1.258～7.356，P=0.006)。目前尚未见PD1多态性与化疗毒副反应之间关系的研究报道，我们推测rs36084323G等位基因能激活PD1基因启动子，上调PD1受体的表达，抑制T淋巴细胞的活化、增殖，进而可能阻碍了化疗后淋巴细胞的生成，加重了化疗后骨髓抑制的程度。当然，这些结果还需要该多态性位点的功能学研究来进一步证实。

综上所述，本研究发现PD1基因多态性与晚期NSCLC铂类化疗临床反应、毒副反应之间存在关联，携带rs2227982T等位基因的患者有更高的化疗反应率，而rs36084323G等位基因携带者更容易出现Ⅲ～Ⅳ度骨髓抑制，该研究结果可能在提升临床化疗效果、减轻毒副反应方面有一定的指导作用。

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