P16和Ki67在老年妇女宫颈病变中的表达及诊断价值

于素香 马为灵 王斌 白云 张金库

宫颈病变是一类疾病的统称，包括子宫颈上皮内瘤变(CIN)1、CIN2、CIN3等，随着病情不断发展，可演变为原位癌[1]。研究表明，子宫颈癌(CC)的发生、发展是一个多因素、多阶段过程，经良性病变、CIN、鳞状上皮癌变的递进过程，亦涉及多个途经的改变，造成细胞增殖失控[2]。P16是一种抑癌基因，能直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂基因。正常细胞内P16蛋白较少，但是在宫颈鳞状细胞癌(CSCC)病人中，其表达水平较高，能引起细胞周期调节紊乱，使细胞无限增殖[3-4]。Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原，其阳性率越高，肿瘤生长越快，能判断肿瘤细胞活跃程度[5]。本研究以老年宫颈病变病人为对象，探讨P16和Ki67在老年宫颈病变病人中的表达水平及其联合检测的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年5月至2019年5月老年宫颈病变病人200例作为研究对象，根据病理类型分为CSCC组、高度鳞状上皮内病变(HSIL)组及子宫肌瘤组(正常组)。CSCC组53例，年龄60～79岁，平均(68.19±4.61)岁，肿瘤直径1～6 cm，平均(3.29±0.61)cm;临床分期：Ⅰ期30例，Ⅱ期23例。HSIL组85例，年龄60～80岁，平均(69.06±5.61)岁。正常组62例，年龄60～81岁，平均(70.04±4.68)岁；病程1～7年，平均(3.25±0.56)年；肌瘤直径1～8 cm，平均(3.31±0.65)cm。本研究经伦理委员会批准，病人和(或)家属均签署同意书。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：(1)符合宫颈病变诊断标准[6]，均经阴道镜检查确诊；(2)拟行手术检查，且病人能完成P16及Ki67蛋白测定，可耐受；(3)意识清楚，能与医生及进行沟通、交流。

排除标准：(1)合并精神异常、血液系统疾病或器质性疾病者；(2)合并凝血功能异常、其他部位确诊的恶性肿瘤者；(3)手术前行放化疗、生物免疫治疗者。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：病人均拟行手术治疗，术中取病灶，术后将获取的标本进行常规石蜡包埋，制备4μm切片，备用。

1.3.2 测定P16、Ki67蛋白表达情况： 采用免疫组织化学法测定不同组织中P16、Ki67蛋白阳性率。向制备的切片中加入3%甲醇双氧水，持续处理10 min，封闭内源性过氧化物酶，PBS连续完成5 min洗涤，连续洗涤3次；加入PBS调整整体溶液pH值为6.0，加入柠檬酸盐缓冲液，缓慢加热，完成缺损蛋白修复。向标本中加入山羊血清完成20 min封闭，加入MDR1、ToPoⅡα、PTER、Livin蛋白一抗，PBS洗涤后缓慢加热，并加入MDR1、ToPoⅡα、PTER、Livin二抗，在湿盒内孵育30 min，37 ℃下加入PBS洗涤，利用DAB显色后显微镜下拍照。

1.3.3 判断标准：免疫组化完毕后，倒置显微镜下观察结构完整、清晰且定位较为明确的细胞；细胞浆、细胞核内呈棕色，颜色明显高于背景[7-8]，即为阳性细胞。

1.4 评价指标 根据各组P16、Ki67阳性表达情况，绘制ROC曲线，分析P16联合Ki67在老年妇女宫颈病变临床诊断中的效能。

2 结果

2.1 3组P16、Ki67蛋白阳性率比较 CSCC组P16、Ki67蛋白阳性率均高于HSIL组和正常组(P<0.05)；HSIL组P16、Ki67蛋白阳性率均高于正常组(P<0.05)，见表1。

表1 3组P16、Ki67蛋白阳性率比较(n，%)

2.2 3组P16、Ki67蛋白免疫组化结果 免疫组化结果表明，CSCC组P16、Ki67蛋白表达水平较高，细胞浆、细胞核内呈棕黄色，且颜色明显高于背景；HSIL组P16、Ki67蛋白呈淡黄色，颜色较淡；正常组P16、Ki67蛋白表达较少或不表达，见图1和图2。

注：A为正常组；B为HSIL组；C为CSCC组图1 不同组织中Ki67蛋白免疫组化结果(×200)

注：A为正常组；B为HSIL组；C为CSCC组图2 不同组织中P16蛋白免疫组化结果(×200)

2.3 P16联合Ki67在宫颈病变临床诊断中的效能 ROC曲线分析结果表明，P16联合Ki67(联合检测时一项阳性即为阳性)(AUC为0.913)在宫颈病变诊疗中的敏感度、阴性预测值高于单一P16(AUC为0.866)、Ki67(AUC为0.835)，特异度低于单一P16、Ki67；不同检测方法阳性预测值差异无统计学意义，见表2，图3。

表2 P16联合Ki67在宫颈病变中的效能

图3 P16联合Ki67在宫颈病变中的诊断ROC曲线

3 讨论

CSCC是临床上较为常见的妇科恶性肿瘤，可分为外生型、内生型、溃疡型及颈管型4种，好发于40～50岁人群中[9]。随着我国人口老龄化的日益加剧，宫颈癌在老年人群中检出率不断上升，可能与病人长期的慢性宫颈疾病有关，导致病人病情恶化或发生癌变。因此，加强老年妇女宫颈病变病人诊断、鉴别诊断对改善病人预后具有重要的意义[10]。

根据《女性生殖器官肿瘤分类》[11]，推荐将P16作为低度鳞状上皮内病变(LSIL)、HSIL诊断的分子生物学指标。本研究中，CSCC组P16、Ki67蛋白阳性率均高于HSIL组和正常组(P<0.05)；HSIL组P16、Ki67蛋白阳性率均高于正常组(P<0.05)，说明P16、Ki67蛋白在CSCC组织中阳性率较高，可能直接参与疾病的发生、发展。肿瘤的发生、发展主要与细胞的过度增殖与凋亡的减少有关[12]。而Ki67作为细胞增殖核抗原，属于增殖抗原中具有代表性的细胞增殖标记之一，其表达水平与肿瘤的浸润、转移、复发等有关，加强其表达水平测定能判断病人病情发展情况[13]。本研究中，免疫组化结果表明，P16、Ki67在CSCC组织中表达水平较高，而在HSIL组织中处于中等表达水平，在正常组织中阳性率较低或不表达，能实现疾病的鉴别。进一步分析P16联合Ki67检测在老年妇女宫颈病变病人中的诊断价值，结果表明，P16联合Ki67(联合检测时一项阳性即为阳性)在宫颈病变诊疗中的敏感度、阴性预测值高于单一P16、Ki67,特异度低于单一P16、Ki67；不同检测方法的阳性预测值差异无统计学意义。因此，老年妇女宫颈病变病人中可加强P16联合Ki67蛋白测定，对于测定结果阳性病人可适当扩大切除范围；亦可根据测定结果指导术后治疗，巩固手术效果，促进病人早期恢复[14]。

综上所述，P16、Ki67在老年妇女宫颈病变病人中表达异常，联合检测P16和Ki67能帮助实现不同疾病的鉴别，其具有较高的灵敏度，可指导临床治疗，值得推广应用。