miR-125a-5p对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖的影响及其与维生素D受体的关系

赵进，王昌敏

新疆维吾尔自治区人民医院，乌鲁木齐830001

多发性骨髓瘤(MM)是一种由于浆细胞恶性增殖导致的血液恶性肿瘤，多发于老年人[1]。MM发病率占所有血液性恶性肿瘤的13%，是临床常见的恶性肿瘤之一[2]。MM的主要临床特征为溶骨性骨病变、高钙血症、肾功能不全、免疫球蛋白水平下降和骨髓血管生成增加等[3]。维生素D是骨骼代谢的基本介质，具有调节钙稳态的作用，维生素D缺乏可影响骨矿化和骨吸收过程。维生素D受体(VDR)属于二类核受体家族，维生素D主要通过作用于VDR而发挥生物学作用。尽管包括蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂在内的新型药物可有效改善MM患者的临床症状，但其整体治疗效果仍不理想，患者中位生存期仅为7年[4,5]。微小RNA(miRNA)是内源性的非编码RNA，主要通过与靶基因mRNA结合而调控基因表达。研究表明，miRNA在包括MM在内的多种癌症的发生和发展过程中发挥重要作用[6,7]。2018年1月～2019年12月，本研究观察了miR-125a-5p在MM细胞中的表达变化及其对细胞增殖的影响，并探讨其与VDR的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞：人多发性骨髓瘤细胞系U266、人正常骨髓原代细胞均购自美国ATCC细胞库。主要试剂：10%胎牛血清购自美国Gibco公司，RPMI 1640培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、oligo dT、SYBR MasterMix均购自上海远慕生物科技有限公司；qPCR试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，TRIzol试剂盒购自日本TaKaRa公司，抗VDR抗体购自美国Abcam公司。miR-125a-5p引物序列由上海生工生物工程有限公司设计合成。

1.2 U266细胞、人正常骨髓原代细胞 miR-125a-5p表达检测 采用实时荧光定量PCR法。将U266细胞、人正常骨髓原代细胞置于含10%胎牛血清和适量青-链霉素的RPMI 1640培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。取生长状态良好的两种细胞，采用TRIzol法提取总RNA，通过逆转录酶在20 μL体系中合成cDNA。miR-125a-5p上游引物5′-AGCGCGTCCCTGAGACCCTTTAAC-3′，长度83 bp；下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，长度164 bp。内参GAPDH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，长度18 bp；下游引物5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′，长度23 bp。PCR反应条件：95 ℃预变性 10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共40 个循环。采用2-ΔΔCt法计算miR-125a-5p相对表达量。

1.3 U266细胞、人正常骨髓原代细胞VDR蛋白表达检测 采用Western blotting法。取生长状态良好的 U266细胞、人正常骨髓原代细胞，在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解细胞，提取总蛋白。BCA法统一定量蛋白样品，随后取相同量蛋白样品通过SDS-PAGE电泳分离。电泳结束后将蛋白质电转移至甲醇浸泡的PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。封闭结束后加入VDR及内参GAPDH一抗(稀释比例分别为1∶1 000、1∶500)，4 ℃孵育过夜；第二天加入HRP标记的二抗(稀释比例为1∶1 000)，室温孵育1 h。TBST洗涤，ECL法显影，条带曝光后采用Image J 软件分析条带灰度值，计算VDR蛋白相对表达量。

1.4 miR-125a-5p与VDR的相互作用观察 TargetScan软件分析结果显示miR-125a-5p可与VDR序列配对，见图1。采用双荧光素酶报告基因检测miR-125a-5p与VDR的相互作用。方法如下：取对数生长期 U266细胞，以1×104/L接种于6孔板，作用24 h。将 U266细胞随机分为四部分，分别采用Lipofectamine 2000转染VDR-wt+NC质粒、VDR-wt+miR-125a-5p mimic质粒、VDR-mut+NC质粒、VDR-mut+miR-125a-5p mimic质粒。转染48 h，加入PLB裂解细胞。将上清液转移至不透光96孔酶标板，加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ(100 μL)反应20 min，采用酶标仪检测荧光素酶相对活性。

图1 TargetScan软件分析miR-125a-5p与VDR序列配对结果

1.5 miR-125a-5p靶向VDR对U266细胞增殖能力影响的观察

1.5.1 细胞分组处理 取生长状态良好的U266细胞，以5×103/孔接种于96孔板。将细胞随机分为inhibitor组、inhibitor+si-VDR组和空白对照组，inhibitor组采用Lipofectamine 2000转染miR-125a-5p inhibitor及si-Con质粒，inhibitor+si-VDR组转染miR-125a-5p inhibitor及si-VDR质粒，空白对照组转染miR-NC及si-Con质粒。

1.5.2 细胞增殖能力观察 ①CCK-8法：三组转染后0、24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，使用酶标仪检测450 nm处的光密度(OD)值。②集落形成实验：将细胞培养液铺于 6 孔板，三组按照1.5.1处理并转染 24 h 后，加入琼脂培养基，调整细胞密度为 1×104/L，混合均匀后接种于铺有下层软琼脂的 6 孔板中。37 ℃、5% CO2培养箱中培养14 d，每孔加入 200 μL噻唑蓝溶液(5 mg/mL)，继续培养过夜，显微镜下观察集落形成情况，并对集落形成个数进行计数。

2 结果

2.1 U266细胞、人正常骨髓原代细胞miR-125a-5p表达比较 U266细胞、人正常骨髓原代细胞miR-125a-5p相对表达量分别为 2.79±0.65、1，二者比较P<0.01。

2.2 U266细胞、人正常骨髓原代细胞VDR蛋白表达比较 U266细胞、人正常骨髓原代细胞VDR蛋白相对表达量分别为0.27±0.06、1，二者比较P<0.01。

2.3 miR-125a-5p与VDR的双荧光素酶报告基因检测结果 转染VDR-wt+NC质粒、VDR-wt+miR-125a-5p mimic质粒的U266细胞细胞荧光素酶相对活性分别为1.00±0.38、0.23±0.05，二者比较P<0.01；转染VDR-mut+NC质粒、VDR-mut+miR-125a-5p mimic质粒的U266细胞荧光素酶相对活性分别为1.02±0.03、1.05±0.04，二者比较P>0.05。

2.4 inhibitor组、inhibitor+si-VDR组和空白对照组细胞增殖能力比较 培养48、72 h， inhibitor组、inhibitor+si-VDR组和空白对照组培养相同时间下的OD值均依次升高，组间两两比较P均<0.05。见表1。inhibitor组、inhibitor+si-VDR组、空白对照组集落形成个数分别为 (143±25)、(359±38)、(421±11)个，组间两两比较P均<0.05。

表1 两组不同时间点细胞增殖能力比较

3 讨论

研究显示，80%～90%的MM患者可出现溶解性骨损伤、高钙血症、病理性骨折和脊髓压迫综合征等临床症状，而骨骼系统相关并发症是导致MM患者死亡的主要原因[8,9]。MM的发病原因至今仍不清楚，现有的研究表明miRNA可能在MM的发生发展过程中发挥重要作用。miRNA是由19～25个碱基组成的短链非编码RNA，其通过诱导靶基因mRNA的降解或抑制翻译来调节基因表达。miRNA的异常表达与人类癌症发生密切相关，包括MM[10]。王金行等[11]研究显示，miR-21可通过下调SPRY2表达而影响MM细胞的增殖和侵袭能力。郁佳佳等[12]研究报道，miR-202可增强MM细胞中B细胞活化因子表达。miR-125a属于microRNA家族，定位于人类19号染色体上。最近的研究表明，miR-125a-5p在多种癌细胞的增殖、迁移和凋亡过程中发挥关键作用。张思毅等[13]报道，miR-125a-5p可抑制喉癌细胞增殖、促进非小细胞肺癌细胞侵袭[14]。但是miR-125a-5p在MM中的作用并不清楚。本研究结果显示，U266细胞miR-125a-5p表达明显高于人正常骨髓原代细胞，且inhibitor组细胞增殖能力明显低于空白对照组；说明U266细胞miR-125a-5p表达升高可促进其细胞增殖能力，证明miR-125a-5p在MM的发生过程中发挥肿瘤促进因子作用。

研究报道，血清维生素D水平降低是导致MM骨骼并发症发生的重要原因[17]。维生素D除了在维持骨骼动态平衡方面的作用外，还具有肿瘤抑制因子作用， 可抑制肿瘤细胞增殖和血管生成，并促进细胞凋亡[18,19]。赵伟强等[20]报道，MM患者血清维生素D3水平显著降低[19]。研究发现，VDR在乳腺癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤中表达异常[21,22]，然而VDR在MM 中的报道并不多见。刘英等[23]曾报道VDR在MM患者中发生点突变，提示VDR在MM发生过程中可能具有重要作用。

本研究TargetScan分析结果显示miR-125a-5p可与VDR序列配对，提示两者之间可能存在靶向关系。进一步采用双荧光素酶报告基因实验进行验证，结果显示miR-125a-5p可与VDR结合而抑制荧光素酶活性，证实VDR是miR-125a-5p的作用靶点。本研究结果显示，U266细胞miR-125a-5p表达明显高于人正常骨髓原代细胞、VDR蛋白表达明显低于人正常骨髓原代细胞，证实miR-125a-5p对VDR具有负性调控作用。一项对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的研究显示，miR-125a-5p可调节VDR的表达，从而影响多发性硬化的发生和发展[15]；另一项关于肝细胞肝癌的研究结果显示，miR-125a-5p mimic可抑制肝细胞癌细胞VDR升高及维生素D的抗肿瘤作用[16]。以上结果均表明，miR-125a-5p与VDR之间存在有靶向关系，且二者之间呈负调控关系，与本研究结果一致。本研究结果显示，inhibitor组、inhibitor+si-VDR组和空白对照组培养48、72 h的OD值以及集落形成个数均依次升高；说明抑制VDR表达可促进U266细胞增殖。因此，U266细胞中miR-125a-5p表达升高，miR-125a-5p可通过负性调控VDR表达而促进细胞增殖。