绿茶多酚对急性脑出血大鼠抗氧化能力及神经细胞凋亡的影响

王红磊 韦红巧 李祝森 秦英 冯勋伟 陈栩栩 陈攀红 周静

广西医科大学1基础医学院生理学教研室，2临床医学专业（南宁530007）

急性脑出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）是指非外伤性脑实质内出血，为当今临床上常见的脑血管疾病之一［1］。研究［2］显示，ACH 发病1 个月内的病死率在我国高达40%，而且多伴随有严重的神经功能缺损症状，预后效果较差，目前对其尚缺乏有效的预防治疗手段［3］。绿茶多酚（green tea polyphenol，GTP）因具有良好的抗氧化、抗凋亡、减轻机体自由基损伤、神经细胞保护、预防心血管疾病等多种功能，在阿尔兹海默病、痴呆等神经系统疾病中都显示出保护作用［4-6］。但关于绿茶多酚应用于急性脑出血方面的相关研究相对较少，本实验通过建立急性脑出血大鼠模型，并给予绿茶多酚进行干预，观察其对大鼠神经功能缺失、脑组织抗氧化能力及神经元损伤的影响，旨在为急性脑出血性疾病的治疗提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器清洁级成年SD雄性大鼠40 只，体质量为240～270 g，由广西医科大学实验动物中心提供［动物合格证号：SCXK（桂）2003-0003］。经过适应性喂养，饮食、饮水正常、无不良反应者，纳入实验；Ⅳ型胶原酶（购自美国Sigma 公司）；绿茶多酚（购自安徽芜湖天远生物科技有限公司，纯度≥98%）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（购自南京建成生物工程研究所）；TUNEL试剂盒（购自上海碧云天公司）；大鼠脑立体定位仪（购自瑞沃德公司）。

1.2 动物分组及急性脑出血模型制备取适应性喂养后的SD 雄性大鼠40 只，随机分为：假手术组、模型对照组和绿茶多酚组，每组又分为3 d和7 d 两个时间点组，假手术组12 只，其他各组14 只。采用胶原酶加肝素脑内定点注射建立大鼠急性脑出血模型：大鼠称重后，10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）腹腔注射麻醉，固定于鼠脑立体定位仪上，常规备皮消毒，沿颅顶正中线切开皮肤，暴露颅骨标志，参照《大鼠脑立体定位图谱》［7］进行左侧内囊定位：前囟后1.8 mm，中线左旁开3.2 mm，深5.4 mm。用牙科钻钻开颅骨，微量进样器抽取含肝素的胶原酶溶液（Ⅳ型胶原酶0.25 U/μL，肝素2.5 U/μL）0.65 μL 校准上述进针点后垂直进针5.4 mm，缓慢注入，1 min 内注完，留针5 min，缓慢退针，缝合头皮。假手术组不注射药物，其余手术过程相同。术后死亡的大鼠被剔除，并补足相应的大鼠数目。

1.3 药物治疗急性脑出血模型制备成功后，绿茶多酚组以60 mg/（kg·d）腹腔注射绿茶多酚，模型对照组和假手术组腹腔注射等量生理盐水，1 次/d，连续给药3 d 或7 d，于末次给药2 h 后进行神经功能和行为学评分，并断头取脑组织进行相关指标检测。

1.4 神经功能行为学评分采用改良Garcia 法［8］进行神经功能行为学评分，测试指标包括：（1）自发性活动（0 分：大鼠完全不动；1 分：大鼠几乎不动；2 分：大鼠刺激后活动；3 分：大鼠活动频繁，至少接触笼子三面）；（2）四肢运动对称性试验（0 分：大鼠右前肢完全瘫痪；1 分：大鼠右前肢轻微移动；2 分：大鼠右前肢小幅度运动；3 分：大鼠四肢对称性伸展）；（3）前爪伸展试验（0 分：大鼠右前肢无移动；1 分：大鼠右前肢轻微移动；2 分：大鼠右侧肢体伸展度小于左侧；3 分：大鼠双前肢伸展）；（4）攀爬试验（1 分：大鼠无法攀爬；2 分：大鼠右侧肢体受损；3 分：大鼠攀爬轻松、抓壁用力）；（5）本体感觉试验（1 分：大鼠右侧肢体无反应；2 分：大鼠右侧肢体反应缓慢；3 分：大鼠两侧肢体反应对称）；（6）对触摸触须的反应（1 分：大鼠右侧肢体无反应；2 分：大鼠右侧肢体反应缓慢；3 分：大鼠两侧肢体反应对称）。神经功能行为学的得分为6 项指标分数的总和，分数越低，表示神经功能障碍越重。

1.5 脑组织MDA 的含量及SOD、GSH-Px 酶活性测定于神经功能行为学评分后，麻醉大鼠，快速断头取全脑，冰生理盐水漂洗干净，分离左脑皮层，滤纸吸干后准确称重，按重量体积比加入9 倍的冰生理盐水制成10 %的匀浆，4 000 r/ min 离心10 min，取上清液保存于-20℃冰箱待测。硫代巴比妥酸（TBA）法测定MDA 含量；黄嘌呤氧化酶法测定SOD 活力；5′，5-双硫代对硝基苯甲酸（DTNB）直接法测定GSH-Px 活力，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 HE 染色处死各组大鼠，留取皮质、海马，置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切为4 μm厚切片，经二甲苯脱蜡及不同浓度乙醇水化后，行HE染色，40倍光镜下观察皮质、海马部位病理学改变。

1.7 TUNEL 法检测细胞凋亡处死各组大鼠，留取皮质、海马，置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋、切为4 μm 厚切片，经二甲苯脱蜡及不同浓度乙醇水化后，用蛋白酶K 于20～37 ℃处理10～30 min。PBS 漂洗3 次后用3%的H2O2于室温处理20 min，随后PBS 清洗3 次。然后按TUNEL 检测试剂盒说明书进行生物素标记，经DAB 显色、苏木素复染、返蓝、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。显微镜下每张切片随机选取5 个高倍镜视野（×400）观察计数，以细胞出现棕色染色为TUNEL阳性细胞，取阳性细胞比率进行统计学分析。

1.8 统计学方法实验数据应用SPSS 20.0 软件进行统计分析，作图采用GraphPad Prism8 软件。计量资料采用均数±标准差表示，组间差异性分析采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能行为学评分与假手术组比较，模型对照组、绿茶多酚组大鼠的神经功能行为学评分均降低（P＜0.001）；给药7 d 后，绿茶多酚组大鼠的神经功能学评分较模型对照组提高（P＜0.05），见表1。

2.2 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后脑组织MDA含量和SOD、GSH-Px 活性变化的影响与假手术组比较，模型对照组、绿茶多酚组的大鼠脑组织中MDA 含量均上升（P＜0.05），而SOD、GSH-Px 活性则下降（P＜0.05）；给药7 d 后，与模型对照组比较，绿茶多酚组大鼠脑组织中MDA 的含量下降（P＜0.05）、SOD 和GSH-Px 的活性上升（P＜0.05），见表2、图1。

表1 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后神经功能行为学评分的影响Tab.1 Effects of green tea polyphenols on neurobehavioral scores after acute intracerebral hemorrhage in rats ±s，分

表1 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后神经功能行为学评分的影响Tab.1 Effects of green tea polyphenols on neurobehavioral scores after acute intracerebral hemorrhage in rats ±s，分

注：与假手术组比较，★P ＜0.001；与模型对照组比较，△P ＜0.05

组别假手术组模型对照组绿茶多酚组动物数12 14 14 3 d 17.67±0.52 11.29±2.43★13.43±1.81★7 d 17.83±0.41 14.43±0.79★15.57±0.98★△

表2 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后脑组织MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性变化的影响Tab.2 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage ±s

表2 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后脑组织MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性变化的影响Tab.2 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage ±s

注：与假手术组比较，★P ＜0.01；与假手术组比较，△P ＜0.05；与模型对照组比较，※P ＜0.05

组别假手术组模型对照组绿茶多酚组MDA 含量（nmol/mgprot）3 d 0.66±0.13 1.03±0.19★0.91±0.21△7 d 0.62±0.19 1.24±0.30★0.89±0.21△※SOD 酶活性（U/mgprot）3 d 1.45±0.19 0.94±0.22★1.10±0.27△7 d 1.46±0.14 1.07±0.14★1.26±0.17△※GSH-Px 酶活性（U/mgprot）3 d 35.34±2.34 30.49±4.55△31.01±3.76△7 d 37.22±2.88 30.82±2.93★33.94±1.53△※

图1 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后脑组织MDA 含量和SOD、GSH-Px 酶活性变化的影响Fig.1 Effects of Green Tea polyphenols on MDA content，SOD and GSH-Px enzyme activity in brain tissue of Rats with Acute intracerebral Hemorrhage

2.3 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后脑组织病变的影响假手术组大鼠皮质、海马组织形态正常，细胞周围间隙正常，细胞核圆润，核染色质均匀清楚；与假手术组比较，模型对照组大鼠皮质、海马组织形态明显异常，组织间隙肿胀，细胞核固缩、浓染甚至破裂，部分细胞出现坏死、消失；给药7 d后，与模型对照组比较，绿茶多酚组大鼠皮质、海马组织形态改善，细胞周围间隙、细胞核固缩程度均减小，神经细胞皱缩程度改善，坏死细胞减少，见图2。

2.4 绿茶多酚对大鼠急性脑出血后脑组织细胞凋亡的影响光镜下可见凋亡（阳性）细胞为棕色，阴性细胞为蓝紫色。与假手术组比较，模型对照组大鼠皮质、海马部位细胞排列松散，神经元凋亡均显著增加（P＜0.001）；给药7 d 后，与模型对照组比较，绿茶多酚组大鼠皮质、海马部位细胞排列重归紧密，且神经元凋亡均显著下降（P＜0.001），见图3。

图2 大鼠皮质、海马部位病理结果比较（HE 染色，×400，n=6）Fig.2 Comparison of pathological results of cortex and hippocampus in rats（HE staining，×400，n=6）

图3 TUNEL 法检测大鼠皮质、海马部位神经细胞凋亡（TUNEL 染色，×400，n=6）Fig.3 Detection of neuronal apoptosis in cortex and hippocampus of rats by TUNEL method(TUNEL staining,× 400,n=6)

3 讨论

急性脑出血是我国临床上常见的一种疾病，具有较高的致残率和病死率，同时也因其有发病急、病情复杂危险、患者预后效果不佳等特点，现已成为临床上的一大难题［9］。氧化应激（oxidative stress）是指当生物体内氧化物与抗氧化物的动态平衡被打破时，所表现出的潜在损伤状态，其参与急性脑出血后的脑组织损伤病理过程，并在神经元损伤过程中具有重要作用［10］。研究证实［11～13］，在急性脑出血后的氧化应激过程中，机体可生成大量的氧自由基和MDA，进而对脑组织产生毒性作用［14］。而过量氧自由基的释放又可以诱导细胞中相关因子的活化，进而导致神经细胞凋亡的发生［15］，而MDA 可加快机体内胺类的氧化代谢，抑制单胺类物质的合成，严重损伤神经功能，亦可引发神经细胞凋亡，进而导致明显的行为学障碍［16］。同时，机体中已存在的能清除或抑制氧自由基的抗氧化物质如SOD、GSH-Px 的含量也会在氧化应激过程中发生大量消耗，使得机体抗氧化能力减弱，利于合成MDA，加剧脑损伤程度［17-19］。本实验中，通过建立急性脑出血大鼠模型，观察到模型对照组大鼠脑组织中MDA 的含量上升，而SOD、GSH-Px活性下降，表明大鼠急性脑出血后脑组织中存在有氧化应激效应以及抗氧化能力的减弱，这与ZHANG 等［20］、ALADAG 等［21］研究结果一致，同时较之假手术组，模型对照组大鼠皮质、海马部位病理损伤明显，神经细胞凋亡增加，也提示脑组织中抗氧化能力的减弱，会导致神经元过度凋亡现象。

绿茶多酚是绿茶中儿茶素类、黄酮类、芬酸类等一系列化合物的总称，其药理活性多样，因其化学结构中包含有多酚羟基，易被氧化而提供出H+质子，故而具有极强的抗氧化能力［22］。已有学者研究发现［23］，在肝、肾及脑损伤导致的氧化应激效应中，绿茶多酚均能够有效增强机体的抗氧化能力，减轻氧化损伤程度，并可以阻断细胞凋亡通路，抑制细胞凋亡过度，进而对受损部位起到一定的保护作用。本实验表明，在给予绿茶多酚治疗7 d 后，与模型对照组的大鼠比较，绿茶多酚组大鼠神经功能行为学评分的得分显著升高，脑组织中SOD 和GSH-Px 活性增加、MDA 水平下降，提示绿茶多酚可以有效改善因急性脑出血导致的神经功能损伤，并可提高脑组织的抗氧化应激能力，同时HE与TUNEL 染色也显示绿茶多酚可改善急性脑出血大鼠皮质、海马部位病理损伤，显著降低神经细胞凋亡，这与DING 等［24］研究结果相似。

综上所述，笔者认为绿茶多酚对急性脑出血后脑损伤的保护作用与其能显著改善急性脑出血后机体的抗氧化能力、减轻神经细胞凋亡有关，这可为绿茶多酚在急性脑出血治疗中的应用提供实验依据。此外，绿茶多酚对急性脑出血后脑损伤中的神经细胞的保护机制有待进一步探讨，这也为急性脑出血性疾病的临床防治提供新的方法和思路。