人工红细胞膜泡的合成及其体外递送阿霉素的可行性

姜津 罗婷婷 潘炜伦 冯俊杰 郑皖程 李博

1广州血液中心（广州510000）；2南方医科大学南方医院检验科（广州510515）；3南方医科大学第一临床医学院（广州510515）

细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是一种细胞膜来源的具有磷脂双分子层膜结构的囊泡，可携带重要信息物质如核酸、蛋白质、脂质以及小分子等进行细胞间通讯［1］。由于EV 可稳定存在于体液循环中，使得其成为具有天然优势的药物递送平台。目前，EV 已被成功用于化学药物、RNA 药物及纳米材料递送系统的构建［2］。但是，由于缺乏高效的纯化和载药方法，EV 作为药物递送平台的应用受到明显限制。故需构建可高效纯化与载药的人工合成脂质体、细胞膜泡等EV 类似物用于药物递送研究［3］。红细胞（red blood cells，RBC）膜同为磷脂双分子层结构，是人工合成EV类似物的重要原料之一。与EV 相比，RBC 更容易从人体中获得，几十年来一直安全、常规地用于输血治疗。且RBC 是体内含量最丰富的细胞类型（约占细胞总数的84%），胞内不含细胞核、线粒体等细胞器［4］，因此红细胞膜可大规模获取并高效提取纯化。在此基础上制备的人工红细胞膜泡（artificial red blood cells membrane vesicle，ARBCMV）可作为递送载体装载不同的成像或治疗材料，应用于疾病的诊断和治疗。最近，通过低渗裂解与物理挤出方法制备的ARBCMV 成功包封声动力治疗纳米颗粒，并在动物体内实验中证实其增强肿瘤造影引导的声动力治疗效果，但其直接装载化学药物的能力尚未得到证实［5-6］。阿霉素是一种常用的蒽环类抗肿瘤化疗药物，抗瘤谱较广，且具有优良的荧光特性和光学稳定性。但其毒性反应大，长期单独使用可造成不可逆的心脏毒性、骨髓抑制等副反应，同时其体内循环时间短，难以达到深层组织肿瘤病灶，构建稳定且安全的载药系统能提高其利用效率并减轻毒副作用［7-9］。因此，有必要探索ARBCMV 负载并递送药物的可行性，从而进一步拓展ARBCMV 在药物递送领域的应用。本研究选用低渗裂解与物理挤出方法制备ARBCMV，以人乳腺癌MDA-MB-231 细胞来源EV为对照，首次通过实验研究比较两者形态、粒径分布及合成效率，在细胞水平验证其与人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的融合，并创新性探索载阿霉素ARBCMV 的载药量及递送阿霉素进入人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的能力，为构建稳定并安全的阿霉素载药系统打下实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料RBC 取自广州血液中心高转氨酶报废血，为经过白细胞滤器的去白细胞悬浮红细胞（400 mL 血袋装，A 型血，2～6 ℃体外保存35 d以内），人乳腺癌细胞MDA-MB-231 细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。磷酸盐缓冲液（Phosphate buffered saline，PBS 1×，pH 7.4，Gibco，500 mL/瓶，C10010500BT-1）、DMEM 培养液（Gibco，500 mL/瓶，C11995500BT-1）、胰酶消化液（Gibco，500 mL/瓶，25200-072）、青霉素-链霉素溶液（Gibco，100 mL/瓶，15140122）、胎牛血清（Gibco，50 mL/瓶，A8160802）、去外泌体胎牛血清（Biolog Ical，50 mL/瓶，C38010050-1）、盐酸-阿霉素（Aladdin，D107159-25 mg）、150 mm 细胞培养皿（Nest，715001）、六孔培养板（Sorfa，220100）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Solarbio，25 g/瓶，A8020-25）、Hoechst 33342 活细胞染色液（Solarbio，50 mL/瓶，C0030-50）、0.22 μm 滤器（Merck millipore，250 个/箱，SLGP033RB）、0.5 mL 超滤管（Merck millipore，100 K，UFC510096-1）、亲脂性染料PKH-67（Sigma，1KT，MINI67-1KT）、0.4 μm 聚碳酸酯膜19 mm（Whatman，800282），0.2 μm 聚碳酸酯膜19 mm（Whatman，800281）

1.2 仪器Avanti 挤出器（上海默格机械有限公司）、ZetaView 纳米颗粒追踪分析仪（英国Malvern公司）、L-80XP 超高速离心机（美国Beckman Coulter 公司），3H16RI 高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），H-7650 透射电子显微镜（日本HITACHI 公司），SCIENTZSB-5200 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），CKX41 倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司）、LS-55 荧光分光光度计（美国Perkin-Elmer 公司）。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌MDA-MB-231细胞来源EV的制备细胞培养：在含有10% 胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM 培养液中培养乳腺癌MDA-MB-231 细胞，待其生长密度为60%～70%时，用PBS 洗涤细胞，加入不含胎牛血清的DMEM 培养液饥饿培养12 h。细胞饥饿处理后再次用PBS 洗涤，加入含有1%去外泌体血清的DMEM 培养液继续培养48 h。收集细胞上清液并随机选择3 皿细胞用牛鲍计数板进行细胞计数。

细胞上清前处理：300 g 离心10 min，2 000 g 离心20 min，10 000 g 离心30 min，离心后均取上清液，最后收集上清液共450 mL。

超速离心法提取外泌体：在离心管中加入36.8 mL 前处理后的细胞上清液，在135 000 g 的条件下4 ℃离心70 min，弃去上清液。再加入36.8 mL前处理后的上清液重悬管底沉淀，以同样条件离心后弃去上清液，用200 μL PBS 重悬沉淀后放置于-80 ℃保存备用。

1.3.2 制备ARBCMV洗涤RBC：对RBC 进行细胞计数，取与MDA-MB-231 细胞数相同的RBC 进行低渗裂解［5］：吸取4.6 μL RBC 稀释至200 μL 冷PBS 中，用高速冷冻离心机4 ℃800 g 离心5 min，弃去上清液，重复3 次。

提取RBC 膜：往洗涤后的RBC 加入200 μL 0.25×冷PBS，放置于冰上低渗裂解红细胞20 min，在4 ℃10 000 g条件下离心5 min，弃去上清液，重复2 次。加入200 μL 纯水重悬沉淀，在4 ℃10 000 g条件下离心5 min，弃去上清液，所得沉淀用PBS 洗涤1 次，最后用1 mL PBS 重悬细胞膜，超声5 min，得到破碎的红细胞膜。

ARBCMV 均一化处理：将所提取的红细胞膜用孔径为400 nm 的聚碳酯纤维膜反复挤压5 次，再用孔径为200 nm 的聚碳酯纤维膜挤压15 次，得到纳米级ARBCMV，保存于4 ℃备用。见图1。

图1 ARBCMV 制备过程Fig.1 Synthesis procedure of ARBCMV

1.3.3 载阿霉素的ARBCMV 制备将阿霉素PBS溶液加入红细胞膜提取液中，用400 nm 聚碳酯纤维膜挤压5 次，再经200 nm 的聚碳酯纤维膜挤压15 次，在4 ℃19 000 g 条件下离心30 min，洗涤沉淀2 次。最后加入PBS 重悬沉淀，得到装载阿霉素的ARBCMV。

1.3.4 ARBCMV 和EV 的比较用透射电子显微镜对ARBCMV 和EV 进行观察，比较两者的形态和结构。用ZetaView 纳米颗粒追踪分析仪对稀释后1 mL ARBCMV 和EV 溶液的颗粒数和粒径分布进行表征，在此基础上对ARBCMV 和EV 分离时间和提取量进行比较，采用两独立样本t检验对两样本数据进行分析。

1.3.5 ARBCMV 与人乳腺癌MDA-MB-231细胞的融合取1 010 个ARBCMV 稀释至250 μL PBS中，加入亲脂性染料PKH-67 对其进行染色5 min，以PBS 为空白对照。再加入500 μL 1% BSA PBS溶液吸附游离染料，用100 KD 超滤管13 900 g 离心10 min，重复洗涤3 次除去多余染料。将MDAMB-231 细胞铺在6 孔板内培养24 h，PBS 洗涤2 次，加 入1 mL 培养液及1 mL PKH-67 标记后的ARBCMV，避光孵育6 h。用PBS 洗涤细胞2 次除去游离ARBCMV 后加入Hoechst 33342 活细胞染料反应15 min，PBS 洗涤两次后在荧光显微镜下进行观察。

1.3.6 载阿霉素ARBCMV的载药量分析配制梯度的PBS 阿 霉素溶液：0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.22、0.26、0.30、0.34、0.50、0.76、1.00 μg/50 μL。分别测量其在488 nm 激发光下，590 nm 处的吸收峰值，根据荧光值绘制阿霉素荧光标准曲线。测量载阿霉素ARBCMV 离心后上清液的荧光值，以及加入的阿霉素的荧光值，通过标准曲线计算得阿霉素量。ARBCMV 载阿霉素量=载药前阿霉素量-载药后上清液中阿霉素量。

1.3.7 ARBCMV 递送阿霉素进入人乳腺癌MDAMB-231 细胞的验证将MDA-MB-231 细胞铺在6 孔板上培养24 h，PBS 洗涤2 次，加入颗粒数为1 010 的载阿霉素ARBCMV 和1 mL 培养液，避光孵育6 h。用PBS 洗涤细胞2 次除去游离ARBCMV后加入Hoechst 33342 活细胞染料反应15 min，PBS洗涤2 遍后在荧光显微镜下进行观察。

1.4 统计学方法采用SPSS19.0 进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用两独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ARBCMV 和EV 的形态与粒径见图2。透射电子显微镜下，ARBCMV 和MDA-MB-231 EV 均为具有完整的膜性脂质双分子层的杯状结构，此结构为进一步装载药物提供空间，直径均为100～200 nm，与文献报道相符［10］。ZetaView 纳米颗粒追踪分析仪检测ARBCMV 和MDA-MB-231 EV 的颗粒数和粒径分布结果，制备出的ARBCMV 粒径峰值为（133.7 ± 5.4）nm，与TEM 的结果相符，浓度为（3.1±1.2）×1010/mL，从细胞上清液中提取的MDAMB-231 EV 粒径峰值为（160.5 ± 4.2）nm，浓度为（10.2 ± 2.4）×1010/mL。结果证实人工制备而来的ARBCMV 粒径相对更均一。

2.2 ARBCMV 和EV 分离时间和提取量比较见表1。ARBCMV 和EV 的分离时间和提取量比较可知，提取EV 需预先成功培养细胞，并超高速离心4 h，操作繁琐且耗时达2～3 d，而ARBCMV 制备仅需普通冷冻高速离心机和挤出器即可完成实验，时长大约100 min。等量细胞可提取的MDAMB-231 EV 平均数量为2.04 × 1010个，ARBCMV 平均数量为3.10 × 1010个，结果差异无统计学意义（P＞0.05）。因此，在相同的细胞数量情况下，可以提取相近的囊泡数量，但制备ARBCMV 无需培养细胞，更加快速且高效，不依赖超高速离心机，对实验室设备要求较低，因此更易于推广应用。

图2 透射电子显微镜图Fig.2 TEM images of ARBCMV

表1 MDA-MB-231 EV 与ARBCMV 分离时间与提取量比较Tab.1 Comparison of isolation time and yield between ARBCMV and MDA-MB-231 EV

2.3 ARBCMV 与人乳腺癌MDA-MB-231细胞的融合见图3。ARBCMV 经过PKH-67 膜染料染色后与细胞共孵育可使人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的细胞膜带荧光，说明ARBCMV 与人乳腺癌MDAMB-231 细胞成功融合，具有作为药物载体并作用于癌细胞的潜力。

图3 ARBCMV 与人乳腺癌MDA-MB-231 细胞的融合荧光图（400×）Fig.3 Fluorescent images of breast cancer cells MDA-MB-231 fused with ARBCMV（400×）

2.4 载阿霉素ARBCMV 的载药量分析通过阿霉素浓度梯度与荧光值检测绘制阿霉素荧光标准曲线。见图4，荧光强度与阿霉素量相关性的回归方程为y=282.230x+4.317，R2= 0.993。载药前，取1 μL 阿霉素PBS 稀释20 倍并测量荧光强度为29.000，代入公式得x=0.087 5，即加入红细胞膜悬液中的1 μL 阿霉素量为1.749 μg。同理取挤出后离心所得上清液1 μL 稀释20 倍后测得平均荧光强度为22.639，代入公式得x=0.064 9，即1 μL 上清液中阿霉素量为1.298 μg。因此，每mL ARBCMV阿霉素载入量为0.451 μg，说明ARBCMV 能负载阿霉素，具有载药的能力。

2.5 ARBCMV 递送阿霉素进入人乳腺癌MDAMB-231 细胞的验证由于阿霉素在488 nm 激发光照射下发射红色荧光，载阿霉素ARBCMV与人乳腺癌MDA-MB-231 细胞共孵育后荧光图见图5。红光荧光的阿霉素成功进入细胞内，可以通过这种方式达到杀伤肿瘤细胞的作用。同时结合图3，证明ARBCMV 能够通过与细胞膜融合递送阿霉素进入人乳腺癌MDA-MB-231 细胞中，具有作为药物递送载体的能力。

图4 阿霉素荧光标准曲线Fig.4 Standard curve of fluorescence intensity of doxorubicin

3 讨论

图5 ARBCMV 递送阿霉素进入人乳腺癌MDA-MB-231 细胞荧光图（400×）Fig.5 Fluorescent images of breast cancer cells MDA-MB-231 treated with doxorubicin loaded ARBCMV（400×）

红细胞在人体血液循环内分布广泛，取材简单方便。本研究在高效提取纯化红细胞膜的基础上制备的ARBCMV，具有与EV 类似的膜性脂质双分子层环状结构，粒径峰值大小为（133.7±5.4）nm，合成效率高且不依赖超高速离心设备，具有负载阿霉素的能力。并在体外实验中证实其负载并递送阿霉素进入乳腺癌细胞的可行性。由于ARBCMV具有流动性的磷脂双分子层，其可直接与靶细胞膜融合，从而提高被包封药物的细胞内化效率，可有效增强治疗效果。ARBCMV 作为药物递送平台的优势如下［11］：（1）具有免疫逃避功能，体内循环时间长；（2）天然的生物相容性和可降解性；（3）避免纳米制剂固有的毒性；（4）可大规模制备，造价低廉。根据文献报道，ARBCMV 包裹的载阿霉素和紫杉醇纳米粒子在体外实验中的肿瘤生长抑制效果大约是紫杉醇和阿霉素的6 倍［12］；此外，ARBCMV 包裹的长春新碱脂质体在胶质瘤小鼠模型体内试验中显示出更长的循环时间和更显著的疗效，与商品化药物相比，ARBCMV仿生纳米颗粒可显著提高小鼠的存活率［13］。因此，ARBCMV有望成为极具潜力的载药递送平台应用于肿瘤诊疗。

然而，由于ARBCMV 的膜结构来源于红细胞膜，作为药物递送平台缺乏治疗靶向性。因此，可以借鉴EV 工程化的方法，对ARBCMV 进行修饰和编辑，以期获得更精准的肿瘤治疗效果。例如，有研究在载阿霉素的EV 表面修饰iRGD 肽段，靶向肿瘤细胞特异性高表达的αv 整合素，增加其肿瘤靶向性，进而有效减小荷瘤小鼠的肿瘤体积［14］。同时，cRGD 环肽可靶向结合αvβ3 整合素，也具有靶向恶性肿瘤细胞的作用［15］。前期研究证实cRGD 修饰在纳米颗粒表面可增加载药纳米颗粒的肿瘤靶向性［16-17］，因此理论上cRGD 修饰的载药ARBCMV 也具有肿瘤靶向性潜力，其治疗效果及体内组织分布有待动物模型实验进一步证实［18］。此外，目前也有研究通过杂化各种囊泡膜结构丰富纳米膜泡功能，如红细胞膜与癌细胞膜的杂化膜包裹抗肿瘤药物［19］，可将免疫逃避的作用与特定肿瘤靶向作用互补，同时发挥红细胞膜与其它功能化膜的优势，用于肿瘤细胞靶向治疗和肿瘤穿透治疗的研究；功能化脂质体与EV 融合增加EV 功能并保存其内在含量和生物特性［20］，提高化疗药物的细胞传递效率等。以上研究均为ARBCMV 功能化修饰，进而为提高肿瘤靶向治疗效率并降低靶外副作用提供借鉴和理论依据。

综上所述，本研究构建了ARBCMV 高效制备平台，合成负载阿霉素的ARBCMV，证实其在体外递送阿霉素进入乳腺癌细胞的可行性，为进一步开发和应用新型ARBCMV 药物递送系统进行肿瘤精准诊疗打下实验和理论基础。