猴头菇外泌体和浸膏对乙醇性胃损伤的抗氧化作用

黄福东，何华奇

(安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100)

大量或长期酗酒是引起胃损伤的重要原因[1]。乙醇及其代谢产物乙醛与胃粘膜直接接触损伤胃粘膜;乙醇通过提高胃粘膜内脂质过氧化水平,使活性氧自由基、超氧阴离子自由基等含量上升,破坏胃粘膜屏障,引起胃粘膜血管通透性增加;乙醇刺激胃酸分泌加重损伤等,最终表现为胃粘膜糜烂和溃疡等炎性反应[2],直接导致如急慢性胃炎、胃溃疡、胃十二指肠复合溃疡、胃的良恶性肿瘤等许多胃部疾病的发生发展。临床上,经常采用胃粘膜保护的药物促进组织修复和溃疡愈合。胃粘膜每天都会受到来自食物和药物的刺激,损伤很容易产生并且持续;耐药性导致强效药物的使用;各种消化道并发症的出现等原因导致胃病原因复杂,易得易复发难根治。可见,胃病作为消化系统常见病、多发病和慢性病不容小觑。《“健康中国2030”规划纲要》提出充分发挥中医药独特优势,加强中药新药研发、新型制剂等创新能力建设,使其在常见病、多发病和慢性病防治中发挥独特作用[3]。

猴头菇(Hericiumerinaceus)属于担子菌纲红菇目猴头菌科猴头菌属,既是食材,又是一味中药材,作为中药单方对于胃部疾病具有很好的治疗和预防作用。猴头菇性平味甘,利五脏、助消化,补虚健胃,扶正培本,说明它能通过修复消化器官损伤,使营养物质被吸收后到达其他脏器并发挥补益作用,符合中医“整体论”的观点。现代医学研究表明,猴头菇可以清除活性氧自由基(ROS,Reactive Oxygen Species)发挥抗氧化的作用[4];改善胃肠粘膜血液循环,减轻局部炎症损害,促进粘膜上皮细胞再生、组织修复,治疗溃疡性炎症[5]。和化药相比,药食同源的猴头菇在消化道疾病的治疗中优势独特,多靶点多效应,治病且养胃。猴头菇成分复杂,除了含有多糖等有效成分外,前期的研究发现猴头菇还含有外泌体(Exosome)的生物成分。外泌体是活细胞分泌的脂质双层膜包被的直径为30～150 nm的囊泡,几乎所有类型的细胞都能分泌。它可以将其运载的RNA(如miRNA、lncRNA)、蛋白质和DNA运输到受体细胞内[6],参与细胞间通信[7],调节肠道粘膜免疫[8],影响细胞微环境[9]等生理和病理过程。猴头菇作为一种药食同源食用菌,其外泌体可能作为一种潜在的纳米尺度的药物成分发挥治疗作用[10]。

本研究以猴头菇外泌体(生物成分)和浸膏(化学成分)为研究对象,考察其对乙醇损伤胃粘膜细胞的作用,为猴头菇预防治疗及保健消化系统疾病提供理论依据,同时对于研发有针对性的无毒副作用的新型纳米药物具有重要临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

猴头菇由安徽科技学院食用菌栽培基地种植培养。

1.2 浸膏的制备

猴头菇子实体成熟期采收，液氮研磨，冷冻干燥成粉末。按照1∶20料液比加入热水浸提2 h，50 ℃浓缩成浸膏，1 g浸膏对应于3 g生药干燥粉末。

1.3 外泌体的提取

成熟猴头菇子实体液氮研磨成粉，组织匀浆器打成匀浆，根据外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，在4 ℃，依次按照1000×g，2000×g，5000×g，10000×g的转速分别离心20 min，每次离心后丢弃沉淀保留上清液，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等依次除去；120000×g离心60 min，弃上清液，2 mL PBS溶液重新悬浮沉淀物，混匀后再以120000×g离心90 min，用100 μL PBS悬浮沉淀物即为猴头菇外泌体，-80 ℃保存。

1.4 电镜鉴定

20 μL外泌体悬液滴至电镜铜网状栅中,使悬液在铜网上保留至少5 min,2%醋酸双氧乙铀溶液负染固定5 min,滤纸吸干,晾干。铜网上样到透射电子显微镜(FEI, Tecnai G2 Spirit BioTwin,美国),观察并拍照记录。

1.5 Nanosight分析

20 μL外泌体悬液用去离子水稀释至1000 μL。用1 mL注射器上样,设置马尔文纳米颗粒跟踪分析仪(NanoSight NS300,Malvern Panalytical Ltd,英国)循环次数和时间,检测。

1.6 乙醇性胃损伤小鼠造模及浸膏处理

将SPF级KM小鼠随机分成6组(正常组、乙醇损伤组和给药组各2组),每组含6只小鼠,雌雄各半。用常规小鼠饲料喂养7 d后,除正常组外,其余各组小鼠开始造模。造模组小鼠称重后按0.1 mL/10 g灌胃无水乙醇[11],造模完成。

小鼠恢复正常饮水摄食,清洁级条件下常规饲养。正常组和乙醇损伤模型组小鼠用生理盐水灌胃,药物组用猴头菇浸膏(2.5 mg/10 g体重)灌胃,每天一次固定时间连续灌胃给药14 d后,处死小鼠,取胃(清除内容物)组织进行观察。

1.7 人胃粘膜细胞GES-1复苏及培养

采取慢冻快融的方法解冻GES-1细胞,转移细胞悬液至离心管中,4 ℃ 1000 rpm离心,加入预热的DMEM培养基(pH 7.4,含胎牛血清10%、青霉素、链霉素)重悬到T-75培养瓶中使其细胞分布均匀,37 ℃下5%CO2细胞培养箱中全湿度培养。接种24 h后更换培养液。以后隔日换液,约4～6天细胞融合达90%后按1∶3传代。显微镜下观察细胞密度,细胞数量达到实验需求即可铺板6孔板,密度达到80%以上,即可加药处理。

1.8 药物分组

细胞分为正常对照组,乙醇损伤组(5%乙醇损伤6 h),药物组(5%乙醇损伤6 h后加入猴头浸膏,终浓度50、100、400 μg/mL)和外泌体组(5%乙醇损伤6 h后加入106个外泌体),分别培养24 h后取样,做后续检测,各设置6个复孔。

1.9 流式细胞技术检测细胞活力和ROS含量

将不同组的细胞被胰酶消化后转入离心管,1000×g离心5 min。弃上清后用1 mL PBS轻轻重悬细胞并计数(细胞数量不少于105),1000×g离心。Binding Buffer重悬细胞后,加入AnnexinV-FITC,混匀,室温避光孵育15 min,加PI(Propidium iodide)染色液,冰浴避光放置5 min。在30 min内进行流式细胞仪(FACSCanto II,BD Biosciences,美国)检测[12],激发波长488 nm,发射波长530 nm检测FITC,大于575 nm检测PI。

吸去六孔板里的培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37 ℃细胞培养箱内孵育30 min以上，用无血清的培养液充分洗涤细胞后0.25%胰酶消化3 min，用完全培养基终止消化，制作细胞悬液，1000×g离心5 min，PBS洗3次后收集细胞沉淀，流式细胞仪检测[13]，激发波长500 nm，发射波长525 nm。

2 结果与分析

2.1 猴头菇外泌体的鉴定

透射电镜可以清楚的看到外泌体的大小、形态等特征,属于鉴定方法中的金标准,粒径分析和标志蛋白检测的方式则作为辅助手段使用。故本论文采取了透射电镜和粒径分析两种方法鉴定外泌体。通过对从猴头菇子实体中提取得到的外泌体样本进行电镜检测,从图1电镜图片中可以看出,囊泡呈现典型的外泌体结构,即杯状双层囊膜结构,直径不等。

图1 透射电镜观察外泌体

通过对外泌体进行粒径测定(图2A),发现,粒径的平均值为239.1±1.8 nm,数量最多的粒径平均为228.2±2.7 nm,中位粒径D50为231.9±2.7 nm。每毫升提取液中含有(2.39×1010)±(7.57×108)个外泌体。通过对外泌体的密度进行分析(图2B),可以发现,在3次检测实验中,不同大小粒径出现的几率无统计学差异,说明粒径检测结果可靠。

图2 外泌体粒径

2.2 猴头菇浸膏对小鼠胃的修复作用

将造模小鼠解剖发现,小鼠胃壁出现弥漫性出血条带(图3A),说明造模成功。灌胃猴头菇浸膏14 d后,出血带几乎消失,损伤减轻(图3B),说明猴头菇对乙醇性胃损伤有一定的修复作用。

图3. 小鼠胃解剖图

2.3 猴头菇降低乙醇损伤胃粘膜细胞的ROS含量

将不同浓度的猴头菇浸膏和外泌体与GES-1共培养(图4),发现,乙醇损伤后(图4B),ROS含量较正常细胞(图4A)升高。分别添加50、100、400 μg/mL的浸膏(图4C、D、E)和1×106个外泌体(图4F)后发现猴头菇组分均能降低乙醇损伤后细胞内的ROS含量。随着浸膏浓度升高,ROS逐渐降低,呈现浓度依赖性的特点。外泌体的作用效果与400 μg/mL的猴头菇浸膏相当。

图4 不同组GES-1细胞的ROS含量

2.4 猴头菇降低乙醇损伤细胞的凋亡

乙醇与GES-1共培养后发现,正常细胞下降至10.31%(图5B),凋亡细胞占绝大多数,说明乙醇对细胞产生严重损伤。当用50、100、400 μg/mL的猴头菇浸膏(图5C、D、E)处理后,正常细胞占比增多,依次为23.30%、30.86%和40.01%。虽然大部分细胞发生凋亡,但相对于乙醇损伤组,早期和晚期凋亡细胞呈逐渐减少趋势,说明浸膏可以使细胞修复,抑制部分细胞凋亡。外泌体组(图5F)正常细胞比例与400 μg/mL的猴头菇浸膏相当,但是晚期凋亡细胞明显减少。

图5 不同药物处理组GES-1细胞的活力变化

3 结论与讨论

猴头菇作为一种药食同源的食用菌,经加工制成的多种剂型,具有养胃和中的功效,用于胃、十二指肠溃疡及慢性胃炎的治疗。猴头菇的药用功效与其所含有的营养成分密不可分。猴头菇(100 g干品)含有蛋白质(22.3 g)、脂肪(3.5 g)、碳水化合物(64.8 g)和多种微量元素。可溶性糖包括阿拉伯糖醇、葡萄糖、甘露醇、肌醇和海藻糖。它还含有16种氨基酸,包括7种必需氨基酸。另外,猴头菇还含有猴头菌碱[14],异猴头菌烯酮[15],多糖[16]等物质。猴头菇含有的丰富的营养成分,为其药用作用奠定了基础。

猴头菇具有的多种生物学功能都与抗氧化功能相关。抗氧化全称是抗氧化自由基,自由基是生物体氧化过程中产生的中间代谢产物。机体不断产生和清除自由基,以保持动态平衡,如果自由基产生过多或是清除过少,过量的自由基会使细胞组织遭受氧化胁迫,造成机体氧化损伤,并可能导致如高血压[17]、糖尿病[18]、肿瘤[19]等许多疾病的发生。猴头菇中含有的丰富抗氧化剂,作为膳食补充剂可用于预防和治疗疾病。猴头菇的乙醇、甲醇和热水提取物具有体外抗氧化活性,可以清除DPPH自由基和抑制脂质过氧化反应[20]。猴头菇多糖可以降低脂质过氧化水平,增加抗氧化酶活性[21-22],改善胃肠粘膜血液循环[23];猴头菇提取物可以减轻局部炎症损害,促进粘膜上皮细胞再生、组织修复,治疗溃疡性炎症[24]。冻干猴头菇子实体提取物可以改善大鼠胃粘膜损伤和水肿,并对乙醇诱导的胃溃疡提供细胞保护作用[25],也可以减轻胃粘膜细胞的损伤[26]。猴头菇乙醇提取物可以抑制ROS的产生,激活抗氧化酶基因的表达从而发挥抗肿瘤作用[27]。猴头菌素A通过刺激活性氧的产生抑制胃癌细胞生长及浸润[28]。猴头菇多糖可以提高机体自身抗氧化酶的活性,降低脂质氧化终产物丙二醛的含量,改善神经退行性疾病的症状[29-30]。本研究中,从猴头菇中提取的浸膏和外泌体均可以降低乙醇损伤的胃粘膜细胞内的ROS水平,发挥抗氧化作用。可见,猴头菇可作为改善氧化应激相关疾病的重要治疗药物,通过修复消化器官的损伤,自身含有的营养物质被消化器官吸收后到达其他脏器并发挥补益作用,这一点成功的避开了西药的各种毒副作用。这些研究成果将为猴头菇对乙醇性胃损伤的干预作用提供证据。

目前,对于外泌体的生理作用的研究正如火如荼的展开,原核生物和真核生物的所有的细胞都可以释放外泌体。外泌体作为天然的胞间信息载体,因其相对较小的分子结构,天然分子转运特性及良好的生物相容性,可以包裹药物运输到病变部位,充分发挥药效,降低毒副作用,实现靶向治疗作用,因此,在药物载体领域存在巨大应用潜力[31-33]。由于外泌体含有大量的信息分子,也可能是一种潜在的天然新型纳米药物。外泌体可以将供体细胞的蛋白质、代谢物和核酸运送到受体细胞中,与受体细胞的细胞器及其他大分子相互作用,参与细胞间交流通讯,有效地改变了它们的生物反应,发挥正常生理和病理功能[34]。这种外泌体介导的反应可以促进或抑制疾病,调节复杂的细胞内信号传递通路,使其在许多疾病的治疗和控制方面的具有潜在的效用。本研究从猴头菇中提取和鉴定了外泌体的生物成分,发现其可以提高正常细胞活力,抑制凋亡,发挥对细胞的保护作用,这些研究成果将为具有药用功能的食用菌成分的研究提供了新的思路,并为新型纳米中药的开发奠定基础。