“李氏薄贴”对荷瘤小鼠的抑瘤作用及促凋亡机制研究❋

肖 寒，方乃青，奚柯婧，秦 艳，李慧刚

(1. 江南大学附属医院，江苏 无锡 214062； 2. 江苏省无锡市锡山区查桥社区卫生服务中心，江苏 无锡 214062)

中国是肝癌高发地区，GLOBOCAN 2012统计显示，全世界50%的肝癌发生于中国，高发区主要集中在江苏、浙江、福建等东南沿海地区[1]。由于临床症状不典型，发现时中晚期患者居多，且肝癌对放化疗不敏感，治疗手段较少，预后差[2]。“李氏薄贴”是经四代医者100多年的共同努力，参照唐代《千金翼方》中的有关处方，遵循中医学辨证与辨病相结合的原则，在民间秘方“消肿止痛膏”的基础上不断完善、创新发展起来的外用方剂，在2010年被无锡市人民政府批准为非物质文化遗产保护项目。主要由中药莪术、参三七、山慈菇、大黄等4味药物组成。在临床应用中，使许多原发性肝癌患者能控制肿瘤，减轻痛苦，缓解症状，延长生命，提高生活质量。本研究应用动物模型对“李氏薄贴”的抗肝癌作用机制进行研究，为进一步开发利用奠定了实验依据。

1 材料

1.1 试验药物

“李氏薄贴”外用膏药由“李氏薄贴”传承人李慧刚配制。药物组成：山慈菇8 g，莪术8 g，参三七5 g，大黄5 g，购自江南大学附属医院中药房，并由药房加工成100目的药粉，按照1∶2的比例将药粉与黑药肉混合加热至60°，涂于塑料薄膜上固定成外用膏药，切制成2×2 cm外用膏药，低剂量组每张2×2 cm膏药含生药量0.3 g(折算成实验小鼠用量为15 g/kg)，高剂量组每张2×2 cm膏药含生药量0.6 g(折算成实验小鼠用量为30 g/kg)。氟尿嘧啶注射液由天津金耀药业有限公司提供(批号H12020959)。

1.2 动物

SPF级昆明种小鼠46只，其中雌雄各23只，20只雌性以及20只雄性小鼠分组供实验用，另6只小鼠供H22瘤株传代用，每只小鼠重约 (20±2) g，购自江南大学动物实验中心(许可证号SYXK(苏)2016-0044)。在江南大学动物实验中心饲养1周，饲养于温度18～22 ℃、湿度50%～60%环境中，给予自由摄食和饮水，提供消毒普通颗粒饲料。

1.3 细胞系

小鼠肝癌 H22 细胞株，购自上海酶研生物科技有限公司。

1.4 试剂及仪器

TUNEL法细胞凋亡试剂盒(批号MK1020)、一抗Bcl-2(批号BM4985)、一抗Bax(批号BA0315-1)及一抗Caspase-3(批号BM4620)均购于武汉博士德生物工程有限公司；苏木素-伊红染液(武汉谷歌生物科技有限公司)；OLYMPUS BX43双目生物摄像显微镜(日本)；JJ-12 J 型脱水机、包埋机(武汉俊杰电子有限公司)；RM2013 病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)；酶标仪(上海研卉生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 H22肝癌小鼠模型的制备

根据参考文献进行造模[3]，首先进行H22肝癌细胞株复苏、培养扩增，调整细胞悬液密度至1×107个/ml，抽取上述细胞悬液0.2 ml注入6只昆明种小鼠腹腔，7 d后抽取腹水，将腹水离心(1200 r/min 5 min)后留取下层含细胞液体。

除模型对照组外，其他3组小鼠在术前禁食12 h，手术前20 min使用10%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，剂量为 3.5 ml/kg。在无菌操作台上，将麻醉后的小鼠仰卧位固定于手术板，沿腹正中线逐层切开，手术切口1 cm左右暴露肝脏，用1 ml 注射器抽取含H22肝癌细胞液体，针头斜刺入肝脏，注入0.05 ml逐层缝合关腹，仔细观察小鼠术后恢复情况，4 d后开始用药。

2.2 给药方法

将40只荷瘤小鼠按随机数字表法分为模型对照组、阳性对照组、低剂量组、高剂量组4组各10只，腹部皮肤表面脱毛处理。其中低剂量组、高剂量组将“李氏薄贴”外用膏药贴敷于腹部肝区，每3 d更换，连续9 d。阳性对照组给予氟尿嘧啶注射液浸润的2×2 cm胶布外贴(内层为含氟尿嘧啶注射液纱布)，每日1次，连续9 d。模型对照组给予0.9 %氯化钠外用，每日1次，连续9 d。9 d后处死小鼠，切取肝脏肿瘤组织称重。计算抑瘤率：抑瘤率=(模型对照组肿瘤质量-药物组肿瘤质量)/模型对照组肿瘤质量×100%。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 HE染色观察细胞学形态 使用10%中性甲醛溶液将小鼠肝脏肿瘤组织固定12 h，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片，烘箱内烘干，使用HE染色法染色，光镜下观察细胞学形态。

2.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡 使用二甲苯对石蜡切片进行2次脱蜡各5～10 min，按顺序放入无水乙醇5 min。接着放入90%乙醇、70%乙醇、蒸馏水各2 min，3%过氧化氢甲醇中浸洗10 min。滴加20 μg/ml蛋白酶K，在室温下孵育20 min。PBS洗涤5 min，连续3次。滴加50 μl的TUNEL反应混合液，37 ℃孵育60 min。PBS洗涤3次，每次5 min×3次，加入50 μl转化剂POD后在湿盒中37 ℃孵育25 min。PBS冲洗后加入50 μlDAB底物溶液，室温孵育10 min，PBS洗涤3次，中性树胶封片后光镜下分析结果。阳性细胞标准为细胞核内出现棕褐色颗粒，每个视野计数200个细胞，每个实验组选取10个视野，按照公式：凋亡指数=阳性细胞数/总细胞数×100%，计算细胞凋亡指数。

2.3.3 免疫组化方法检测肿瘤组织中Bax(Bcl-2基因相关蛋白X)、Caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)、Bcl-2(B细胞性淋巴瘤/白血病-2基因)的表达情况 免疫组化检测使用SP三步法，严格按照试剂盒说明书进行操作。石蜡包埋的肿瘤组织切片、脱蜡水化，PBS缓冲液冲洗后利用微波炉进行抗原修复，自然冷却后加3%H2O2室温下孵育。PBS冲洗后加入一抗，经孵育冲洗后加入二抗，DAB 染色，苏木素复染后常规脱水、透明、干燥、封片，在光学显微镜下观察胞浆中出现棕黄色颗粒或棕褐色颗粒细胞为阳性细胞。采用图像处理分析软件Image-Pro Plus 6.0对Bax、Caspase-3、Bcl-2的表达进行定量分析，计算并得出平均光密度值(IOD/Area)进行统计分析。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 各组小鼠抑瘤率分析

表1图1示，“李氏薄贴”低剂量组以及高剂量组和模型对照组比较，肿瘤组织质量均有降低，其中高剂量组和模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与使用氟尿嘧啶阳性对照组比较，高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，说明高剂量组与氟尿嘧啶一样能抑制肿瘤生长，而“李氏薄贴”低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，说明低剂量组抑制肿瘤生长效果欠佳。“李氏薄贴”高剂量组、低剂量组抑瘤率分别为38.97%、13.47%，提示“李氏薄贴”可抑制肿瘤生长，其中高剂量组效果较好。

表1 各组小鼠瘤重与抑瘤率分析比较

3.2 HE染色结果

图2示，模型对照组的病理切片中，蓝色的为染色后的细胞核，红色为细胞浆，细胞结构清晰，形态不规则，呈现多边形，核较正常细胞大且形态各异，可见较多的核分裂，核浆比例失调，毛细血管丰富，部分区域存在坏死组织，说明肝癌细胞生长迅速。“李氏薄贴”高剂量组图中可见，细胞浆肿胀呈空泡状，细胞核固缩、坏死，毛细血管数量明显减少，血管腔变细，说明肿瘤细胞有一定程度的凋亡。“李氏薄贴”低剂量组图中可见少量细胞浆呈空泡状，少量细胞核固缩、坏死，说明肿瘤细胞凋亡程度较轻。阳性对照组与高剂量组相类似，细胞浆肿胀明显，可见到大量细胞核固缩、坏死，说明细胞凋亡程度高。

3.3 TUNEL检测结果

图2B组图片示，光镜下发现模型对照组几乎没有阳性细胞(细胞核显棕黄色的凋亡细胞)，细胞排列紧密呈蓝色，低剂量组偶可见阳性细胞，而阳性对照组以及高剂量组出现大量棕黄色阳性细胞。表2示，通过凋亡指数的统计，与阳性对照组比较，低剂量组凋亡指数处于低水平，差异有统计学意义(P<0.05)，而高剂量组与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，与模型对照组比较，低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，但高剂量组凋亡指数明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，说明高剂量组和化疗药物氟尿嘧啶一样具有较强的促进细胞凋亡作用，而低剂量组促细胞凋亡作用较弱。

3.4 肿瘤组织中Bcl-2、Bax及Caspase-3的表达差异

表2图4示，与模型对照组比较，“李氏薄贴”高剂量组Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)，无论是“李氏薄贴”高剂量组还是低剂量组Bax、Caspase-3凋亡相关蛋白的表达都是显著增加，其平均光密度值(IOD/Area)显著升高，差异有统计学意义 (P<0.05)。与阳性对照组比较，“李氏薄贴”低剂量组Bax、Caspase-3表达水平明显下降，Bcl-2表达水平增加(P<0.05)，而“李氏薄贴”高剂量组与阳性对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明高剂量组引起细胞凋亡程度与阳性对照组相当，而低剂量组由于剂量的关系，凋亡相关蛋白表达程度与阳性对照组比较还有一定差异。这一结果提示“李氏薄贴”可以通过降低抑凋亡蛋白Bcl-2表达，提高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达以达到促进肝癌细胞线粒体途径凋亡，且具有一定的量效关系。

表2 各组小鼠凋亡指数及凋亡相关蛋白表达差异比较

4 讨论

“李氏薄贴”由莪术、参三七、山慈菇、大黄、大戟等数十味主要药物组成，其中山慈菇、莪术、参三七3味为主要药物。山慈菇的功效为清热解毒，消痈散结，在临床上主要用于治疗痈肿、瘰疬、疔毒、淋巴结核等[4]。经现代药理研究发现，山慈菇的提取物对结肠癌(HCT-8)、肝癌(Be17402)、胃癌(BGC-823)、肺癌(A549)、乳腺癌(MCF-7)和卵巢癌(A2780)细胞表现出非选择性中等强度的细胞毒活性，能有效抑制血管内皮祖细胞管腔形成和细胞迁移，它是一种新的抗血管生成抑素，应用于血管增生性视网膜病变和肿瘤的治疗[5]。莪术油是常用的抗肿瘤中药材莪术的提取物，它可以促进人子宫内膜癌细胞凋亡，作用机制为上调凋亡相关bax基因，以及下调bcl-2基因，促凋亡作用与浓度以及时间成正比[6-7]。三七总皂苷是一种多靶点抗肿瘤中药，其特点是高效低毒，也就是说它对正常组织细胞毒性低，对肿瘤细胞毒性高，有直接杀伤和抑制肿瘤细胞生长的作用，能诱导肿瘤细胞凋亡，同时可以增强机体免疫功能等多重机制抗肿瘤[8]。由此可见，“李氏薄贴”的主要成分均具有一定的抗肿瘤作用。

细胞凋亡存在两条主要信号通路[9-12]，一条为内在的线粒体通路和另一条为外在的死亡受体信号通路。在线粒体通路中，当凋亡刺激因素作用下，可引起线粒体外膜通透性增加，细胞色素c从线粒体

释放入胞质，引发caspases级联反应，从而诱发细胞凋亡。其中，bcl-2家族蛋白是在线粒体凋亡通路中起重要调控作用的一类蛋白。Bcl-2家族蛋白按功能可分为促进和抑制细胞凋亡两大类成员，即具有抑制凋亡作用的蛋白有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等，具有促进凋亡作用的有Bax、Bd-Xs等。胞外的死亡信号可通过Fas等死亡受体转入胞内[13-14]。Fas是细胞表面重要的死亡受体，细胞在接收到经Fas传递的凋亡信号后，可以通过Fas I型通路和Fas II型信号通路引发细胞凋亡。Fas受体介导的caspase-8的量不足以直接激活凋亡执行酶caspase-3。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体通路来放大，线粒体为启动下游的凋亡执行环节caspase级联反应提供放大信号。外源性和内源性凋亡途径最终都依赖caspase-3的激活，它是细胞凋亡的关键性执行分子，caspase-3一旦被激活细胞凋亡则不可避免。

在本研究中发现，“李氏薄贴”高剂量组能抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，在光镜下有细胞凋亡的表现。TUNEL法检测发现，其凋亡指数高于低剂量组，与阳性对照组相当，说明“李氏薄贴”能通过诱导肝癌细胞凋亡而起到抑制肝癌的作用。但它是通过什么途径发挥作用的呢？进一步利用免疫组化方法对肿瘤组织进行染色发现，肿瘤组织Bax、Caspase-3表达上调、Bcl-2下调，推测该药是通过增加Bax及Caspase-3的表达、抑制Bcl-2的表达来发挥抑瘤效应的。这一实验结果恰好说明“李氏薄贴”的作用机制与线粒体途径引起肝癌细胞凋亡相关。下一步研究将进一步对“李氏薄贴”从分子及基因水平验证其作用机制是否存在其他作用途径，为产品开发提供理论依据。