海拔3 650米西藏地区体外受精新鲜周期和冻融周期胚胎移植后临床结局的分析

唐刚，吴斌，李君*，谢丽平，姜林龙，孟祥黔

(1. 西藏阜康妇产儿童医院生殖医学中心，拉萨 850000；2.川北医学院附属医院妇产科生殖医学中心，南充 637000；3.成都锦江区妇幼保健院生殖中心，成都 610016)

西藏地区被称为“世界屋脊”，平均海拔4 000米以上，地域环境十分特殊，寒冷、低氧、低气压、强紫外线、异常干燥的气候对该地区男性和女性生育率有一定影响[1-2]。目前，西藏阜康妇女儿童医院生殖医学中心是西藏地区第一家开展“试管婴儿”技术的医疗机构，地处海拔3 650米的拉萨市区，也是全世界海拔最高的生殖医学中心，且目前尚无其他机构在海拔3 000米以上地区开展IVF-ET技术的报道。自从2016年报道了西藏地区首例试管婴儿成功妊娠以来[3]，我中心在高海拔地区不断探索体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI- ET)技术，现将2016年6月至2018年3月期间完成的303个治疗周期的临床结局做回顾性分析，旨在探讨高海拔地区体外受精新鲜胚胎或冻融胚胎移植的临床应用价值。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年6月至2018年3月期间在西藏阜康妇女儿童医院生殖医学中心接受IVF/ICSI-ET治疗的193例不孕症患者的临床资料。纳入标准：(1)不孕年限≤10年；(2)无遗传性及家族性病史；(3)不孕原因为盆腔输卵管因素或男方因素。排除标准：(1)有习惯性流产史；(2)子宫畸形、合并子宫肌瘤、子宫腺肌症；(3)取消移植及合并移植周期的。根据女方患者年龄分为≤35岁组和>35岁组，每组又分为新鲜周期组和冻融周期组。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COH)方案：根据不孕患者年龄、基础激素水平等采用长方案或短方案。于月经第2天或第3天采用尿促性素(HMG)或卵泡刺激素(FSH)促排卵，B超监测卵泡发育情况，当B超显示有至少3个直径≥18 mm的卵泡时，给予肌肉注射HCG(珠海丽珠制药)5 000～10 000 U，35～36 h后行经阴道B超引导下卵泡穿刺取卵术。

2.IVF/ICSI及胚胎培养：精液处理采用上游法或密度梯度离心法。卵子及胚胎培养选择澳大利亚COOK或瑞典Vitrolife序贯培养液，采用序贯法培养：培养箱CO2浓度设定为4.5%、O2浓度设定为5.5%；气体浓度监测仪日常检测结果范围：CO2浓度4.5%～4.7%，O2浓度5.4%～5.6%；提前准备的培养液须在培养箱内平衡8 h以上再使用；观察原核及胚胎发育情况；评估胚胎质量级别；选择新鲜可用胚胎移植，其他可用胚胎冷冻保存，或者将全部可用胚胎冷冻保存，择期行解冻复苏移植。行常规IVF或卵胞浆内单精子注射(ICSI)。

3.临床结局诊断：移植后14 d采血，全血β-HCG值≥10 U/L即为HCG阳性。移植后35 d行B超检查观察到宫内孕囊和胎心搏动诊断为临床妊娠[4]。

三、统计学分析

结 果

一、患者一般资料比较

本研究共纳入193例患者，303个治疗周期，其中78个新鲜胚胎移植周期和225个冻融胚胎移植周期。≤35岁组的新鲜周期组纳入65个周期、冻融周期组纳入173个周期，两组间患者年龄、体重指数、不孕年限、基础FSH、内膜厚度、移植胚胎数目均无显著差异(P>0.05)。>35岁组的新鲜周期组纳入13个周期、冻融周期组纳入52个周期，两组间患者年龄、体重指数、不孕年限、基础FSH、内膜厚度、移植胚胎数目亦均无显著差异(P>0.05)(表1)。

二、临床结局比较

1.不同年龄组的实验室观察指标比较：≤35岁组的获卵数显著高于>35岁组(P<0.05)，但两组间正常受精率和D3优质胚胎率无显著差异(P>0.05)(表2)。

表1 不同年龄组新鲜周期和冻融周期患者的一般情况比较(-±s)

表2 不同年龄组早期胚胎发育结局的比较[(-±s)，%]

2.不同年龄组内新鲜周期与冻融周期妊娠结局比较：≤35岁组中，与新鲜周期组相比较，冻融周期组的临床妊娠率、种植率以及活产率均较高，但无显著差异(P>0.05)，且两组间的流产率、异位妊娠率以及多胎率的亦均无显著差异(P>0.05)。>35岁组中，与新鲜周期组相比较，冻融周期组的临床妊娠率、种植率以及活产率也是均较高，但无显著差异(P>0.05)，且两组间的流产率以及多胎率亦无显著差异(P>0.05)，两组均无异位妊娠发生(表3)。

表3 不同年龄组新鲜周期和冻融周期患者的妊娠结局比较(%)

3.新鲜周期不同年龄组妊娠结局比较：≤35岁组的临床妊娠率、种植率、活产率虽高于>35岁组，但无显著差异(P>0.05)，两组流产率亦无显著差异(P>0.05)(表4)。

4.冻融周期不同年龄组妊娠结局比较：≤35岁组的种植率、活产率显著高于>35岁组(P<0.05)，但两组间临床妊娠率和流产率无显著差异(P>0.05)(表5)。

表4 新鲜周期不同年龄组患者妊娠结局的比较(%)

表5 冻融周期不同年龄组患者妊娠结局的比较(%)

讨 论

西藏自治区位于世界屋脊之称的青藏高原，平均海拔4 000米以上，常住人口约320万，不孕不育患者约有11万人。缺氧干燥的特殊气候使该地区不孕不育患者具有独特的临床特征，患病率相比平原地区较高[1-2]。西藏地区辅助生殖技术(ART)起步较晚，不孕症人群年龄偏大，西藏阜康妇女儿童医院生殖医学中心地处海拔3 650米的拉萨市区，成功开展试管婴儿技术，填补了西藏地区在该技术领域的空白[3]。

由于拉萨地区高海拔、低气压、相对湿度过低的极端气候，这些环境因素可能对胚胎实验室培养条件造成负面影响，因此胚胎实验室的质量控制显得十分重要。我中心制定了严格的实验室质控制度，包括环境质控、培养箱等设备质控、培养液及耗材的质控。实验及手术区均安装了层流净化空调，由于室外环境相对湿度较低，实验室内增置加湿器，使相对湿度维持在40%～60%，实验室室内温度维持在22℃～25℃，温湿度每天检测，每月进行沉降菌培养实验。

胚胎培养体系的稳定性是胚胎实验室质控最关键的环节，除了实验室内环境之外，培养液直接接触胚胎，模拟体内胚胎发育环境，是胚胎生长发育的关键点[5-6]。因此摸索培养液在海拔3 650米的稳定性和最佳pH值极其重要。目前国内外IVF实验室均使用商品化的培养液，适合胚胎生长发育的最佳pH值范围7.2～7.4已基本形成共识。不同品牌的培养液对培养箱CO2浓度有各自的规定，COOK培养液生产商建议海拔3 650米的拉萨市区，应将培养箱的CO2浓度设定在9.5%～10%，我中心利用血气分析仪检测COOK培养液(受精液、卵裂液、囊胚液)在不同CO2浓度(4.5%～7.0%)下平衡不同时间(12 h、24 h、48 h、72 h)后的pH值变化情况，并利用鼠胚实验验证胚胎培养环境的可靠性，结果显示：随着CO2浓度升高，pH值呈整体下降趋势，浓度高于7%时，pH值已低于7.2。经过对比，在4.5% CO2浓度下，培养液平衡不同时间的pH值变化较小且均在生产厂商规定的使用范围内(7.3～7.5)，同时鼠胚发育良好，达到IVF实验室的胚胎培养条件，但这与培养液生产商提供的数据并不相符[7]。

将本研究中的新鲜周期≤35岁组和>35岁组患者临床妊娠率(36.92% vs. 23.08%)与平原地区的安徽医科大学第一附属医院生殖中心(安徽合肥，海拔100米以下)2014年报道的数据(37.46% vs. 25.97%)[8]以及河南省人民医院生殖中心(河南郑州，海拔约100米)报道的数据(48.27% vs. 30.25%)[9]相比较，均无显著差异(P>0.05)。冻融周期≤35岁和>35岁患者临床妊娠率(49.71% vs. 40.38%)，与国内某些低海拔平原地区，如河南省人民医院生殖中心2018年报道的数据(55.22% vs. 41.39%)[9]、无锡市妇幼保健院生殖中心(江苏无锡，海拔8米)报道的数据(52.42% vs.37.40%)[10]相比较，均无显著性差异(P>0.05)。然而，冻融周期总体妊娠成功率(47.55%)显著低于韶关妇幼保健院(广东韶关，海拔35米)报道的数据(55.48%)[11](P<0.05)，可见缺氧、寒冷干燥、低气压的气候对IVF-ET技术可能会有影响，但事实证明在海拔3 650米地区实施体外受精-胚胎培养-胚胎移植技术助孕是完全可行的。

本研究得到的≤35岁组新鲜周期和冻融周期的活产率(32.31% vs.41.04%)，低于平原地区(河南郑州)的水平(42.73% vs. 47.33%)[9]以及无锡市妇幼保健院报道的<35岁活产率(44.43%)[10]，但差异无统计学意义(P>0.05)；流产率(12.50% vs.17.44%)略高于平原地区(河南郑州)(11.48% vs. 14.28%)[9]，但差异无统计学意义(P>0.05)。也可能由于本研究周期数偏少，结果不准确所致，或者是因为高原地区和平原地区地理环境差异性所致，尚待进一步研究明确。

本研究结果显示，与≤35岁组相比较，>35岁组的冻融周期活产率、种植率均显著降低，这与国内其他地区的的报道相一致[8-10，12]，表明了女性年龄依然是影响IVF-ET成功率的重要因素。随着女性年龄的增长，卵巢储备功能越差，IVF治疗获得的卵泡数越少，最终影响妊娠成功率[13-14]；另外，卵母细胞内线粒体数量和功能逐渐下降，能量供应不足影响细胞分裂；活性氧自由基(ROS)增加，对线粒体DNA和蛋白质造成损伤，影响了微管和微丝间的动态平衡，导致卵母细胞染色体异常分离和非整倍体的产生，卵母细胞质量下降，优质胚胎数减少，种植率和临床妊娠率显著降低，胚胎染色体异常率及流产率增加[15]。本研究结果显示两个不同年龄组的临床妊娠率和流产率无显著性差异，原因可能是>35岁组周期数较少，统计结果不准确所致。还有研究认为，较高剂量的Gn会影响卵母细胞的正常分裂、代谢，改变其表观遗传学特征，使胚胎发育潜能降低；另外，随着年龄增长，女性子宫内膜形态和功能也会发生一系列变化，比如：子宫内膜血供减少、内膜病理性变化增加、内膜细胞性激素受体减少等，均可导致子宫内膜容受性下降，胚胎种植率降低[16-17]。

随着胚胎玻璃化冷冻技术的不断改进和广泛应用，越来越多研究证明冻融周期的临床妊娠率、种植率和活产率均高于新鲜移植周期。2016年，Chen等[18]首次证实在多囊卵巢综合征患者中，冻融周期胚胎移植与新鲜周期胚胎移植相比可以显著提高新生儿的活产率。Ozgur等[19]的研究也证实冻融周期能够获得与新鲜移植周期相似甚至更好的临床结局。赵华等[9]的研究认为由于促排卵周期患者的激素水平较高，导致着床窗口期提前关闭，使胚胎发育与内膜容受性不能同步化，使新鲜胚胎移植临床妊娠率显著低于冻融周期。本研究结果显示无论>35岁组，还是≤35岁组，冻融周期的临床妊娠率、种植率、活产率均高于新鲜周期组，但无显著差异(P>0.05)。本研究纳入的≤35岁新鲜周期组65个周期，>35岁新鲜周期组仅13个周期，周期数偏少，明显少于冻融周期数量。主要因为我中心在起步阶段，考虑到高海拔地区的特殊性，也为保证临床妊娠率和避免卵巢过度刺激综合征的发生，多数患者选择了全胚冷冻策略，待技术逐渐成熟后，会进一步扩大新鲜胚胎移植周期。

综上所述，在海拔3 650米西藏地区开展IVF-ET助孕技术可以获得较好的临床结局，女性年龄仍然是影响IVF-ET成功率的关键因素，为高海拔地区“试管婴儿”技术的临床应用价值提供数据支持。但目前IVF-ET治疗周期数量有限，有关影响海拔3 650米地区IVF-ET成功率的因素，有待进一步深入研究。