严重少精子症患者行卵胞浆内单精子注射治疗单个取卵周期累积活产率分析

倪运萍，陆杉，卢兴宏，徐珉，刘娟，王爱爱，袁启龙，谢妍，杨冬宇，周文

(广州中医药大学第二附属医院生殖医学科，广州 510006)

自1992年比利时学者Palermo等[1]报道采用卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)成功使不育患者获得妊娠以来，其技术越来越成熟，中国辅助生殖界已将ICSI技术列为解决男性严重少、弱、畸及无精子症患者生育的最佳选择[2]，让越来越多的男性严重精子异常不育患者获得了生育子代的机会。

随着冷冻技术的发展，冻融胚胎移植(FET)不断增加，在评估辅助生殖技术(ART)助孕疗效时，大部分文献研究均关注其整体患者的最终助孕结局，并就累积活产率提出了越来越多的探讨[3-5]，却较少有文献对因特定因素行助孕治疗的最终结局进行分析。本研究对因男方严重少精子症为主要指征纳入ICSI治疗的患者助孕结局进行分析，以单个取卵周期为节点报道累积临床妊娠率及累积活产率。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2014年1月至2019年9月在本院生殖医学科以男方严重少精子症(精子浓度<5×106/ml)为主要适应证接受ICSI治疗的187对不育夫妇为研究对象。其中8对夫妇女方染色体无异常，男方伴有引起不育或流产的染色体异常(包括染色体微缺失)，单独列出分析。因此，最终纳入179对不育夫妇的240个取卵周期的助孕数据，按照女方年龄分为≤35岁组、36～39岁组、≥40岁组；按照获卵数不同分为≤5枚组、6～10枚组、11～15枚组、≥16枚组。

纳入标准：以男方严重少精子症(包括严重少弱精子症)为主要适应证纳入ICSI治疗；夫妻双方染色体检测正常(可包含染色体正常多态性不影响生育者)。排除标准：合并女方因素引起的不孕症，如存在引起着床失败的宫腔因素/患有Ⅲ期-Ⅳ期子宫内膜异位症/子宫腺肌症等；供卵、供精及代孕治疗患者；行胚胎移植前遗传学检测(PGT)患者。

二、研究方法

1.促排卵方案：符合因男方严重少精子症拟行ICSI助孕标准的夫妇，女方进行促排卵治疗，促排卵方案选择标准如下：(1)常规采用长方案或拮抗剂方案治疗；(2)选择微刺激方案或黄体期促排卵方案治疗的患者：低反应患者，长方案或拮抗剂方案获卵数≤3个未获得妊娠者，AFC≤3个者。

2.取卵及受精：女方卵泡达到常规取卵标准后，晚上注射人绒毛膜促性腺激素(珠海丽珠)5 000～10 000 U，或重组人绒毛膜促性腺激素(默克雪兰诺，瑞士)250 μg；拮抗剂方案为预防卵巢过度刺激综合征(OHSS)发生采用醋酸曲普瑞林(辉凌，瑞士)0.2 mg扳机，36～38 h后行经阴道B超引导下取卵。精子获得均为手淫取精方式获取，处理采用直接洗涤法，授精方式为ICSI。

3.胚胎移植及黄体支持：新鲜周期移植患者取卵后第3日进行卵裂期胚胎移植，或取卵后第5日进行囊胚移植；冻融周期移植患者转化内膜第4日行卵裂期胚胎移植或第6日行囊胚移植。取卵后当日或冻融周期转化内膜日即开始给予黄体酮注射液(湖南康都)40 mg/d肌肉注射，或使用阴道黄体酮凝胶(默克雪兰诺，瑞士)90 mg/d阴道给药，并加用地屈孕酮(雅培，美国)20 mg/d口服。

4.随访及观察指标：胚胎移植后随访至分娩。观察指标为获卵数、可利用胚胎数、无可利用胚胎率、平均移植胚胎数(包括卵裂期胚胎和囊胚)、平均移植优胚数(包括优质卵裂期胚胎和优质囊胚)、累计临床妊娠率、活产率。本研究中累积活产率的计算参照2018年中国专家共识进行，以单个取卵周期累积活产率进行计算[6]。

三、统计学分析

采用SPSS 24.0统计学软件进行数据处理。计量资料比较采用单因素ANOVA检验，组间计量资料比较采用LSD法；计数资料采用χ2检验及Fisher’s精确检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般情况

179对夫妇接受240个ICSI助孕周期治疗，女方取卵次数为1～6次，15个取卵周期未获得可利用胚胎，20个取卵周期在全胚冷冻后尚未进行胚胎移植，随访单个取卵周期累积临床妊娠率为61.36%(135/220)，28个取卵周期移植后尚在持续妊娠中，7个取卵周期(5.19%，7/135)发生自然流产，2个取卵周期(1.48%，2/135)发生异位妊娠；截至目前随访单个取卵周期累积活产率为50.00%(96/192)。

二、不同女方年龄分层助孕情况及妊娠结局比较

≤35岁组、36～39岁组、≥40岁组进行比较，获卵数、可利用胚胎数、累积临床妊娠率及活产率均有统计学意义(P<0.05)，随着女方年龄的增加，获卵数、可利用胚胎数、累积临床妊娠率及累积活产率均呈下降的趋势。≥40岁组无可利用胚胎率显著高于其他两组(P<0.05)；≤35岁组、36～39岁组两组间无可利用胚胎率比较无显著性差异(P>0.05)。3组平均移植胚胎数比较无显著性差异(P>0.05)。平均移植优质胚胎数比较，仅≤35岁组显著高于≥40组(P<0.05)，其余两组比较无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同女方年龄组间助孕结局比较[(-±s)，%]

三、不同获卵数分层助孕情况及妊娠结局比较

不同获卵数组间比较，随着获卵数的增加，可利用胚胎数显著增加(P<0.05)。获卵数≥6枚的各组与≤5枚组比较，女方年龄、无可利用胚胎率、平均移植胚胎数、平均移植优胚数、累积临床妊娠率、累积活产率均显著升高(P<0.05)。获卵数6～10枚、11～15枚及≥16枚组间比较，女方年龄、无可利用胚胎率、平均移植胚胎数、平均移植优胚数、累积临床妊娠率及累积活产率均无显著性差异(P>0.05)，但随着获卵数的增加，累积临床妊娠率及累积活产率仍有增加的趋势(表2)。

表2 不同获卵数组间助孕结局比较[(-±s)，%]

四、获卵数≤5枚患者不同年龄分层的助孕结局比较

将获卵数少(≤5枚)的患者分为≤35岁组和>35岁组，数据显示，≤35岁组的累积临床妊娠率及累积活产率均显著高于>35岁组(高龄患者)(P<0.05)；≤35岁、>35岁组间无可利用胚胎率、平均移植胚胎数及平均移植优胚数比较无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 获卵数≤5枚患者不同年龄分层助孕结局比较[(-±s)，%]

五、男方染色体异常患者助孕结局

共有8对合并男方染色体异常(影响生育)的夫妇接受了13个取卵周期治疗，占比4.28%(8/187)；其中7例患者伴有Y染色体微缺失，占比3.74%(7/187)。这部分患者在接受ICSI助孕前，均已接受遗传咨询，已知情了解相关可能存在的遗传风险，患者均要求行ICSI助孕治疗，暂拒绝行与性别相关的PGT治疗。1例患者取卵2个周期，总获卵33枚，但均为未成熟卵，两个周期均未获得可利用胚胎；1例患者取卵1个周期，获卵22枚，仅获得2枚可利用胚胎，FET未获得妊娠；另1例患者取卵2个周期，共获卵17枚，获得3枚可利用胚胎，移植后未获得妊娠。余5例患者共6个取卵周期获得临床妊娠，单个取卵周期累积临床妊娠率为46.15%(6/13)。1例47，XY，+mar患者早期自然流产，之后移植未再获得妊娠。4例患者共4个取卵周期获得活产分娩，单个取卵周期累积活产率为30.78%(4/13)，1例分娩1名男婴，其余3例各分娩1名女婴。活胎分娩患者中，其中1例患者第1取卵周期发生异位妊娠，第 2取卵周期获得活胎分娩；另1例患者新鲜周期移植妊娠后发生自然流产，FET周期获得活胎分娩(表4)。

表4 染色体异常患者助孕结局

讨 论

近年来，ICSI技术解决了男性严重少精子症患者的生育问题，但目前鲜见因男方严重精子异常行ICSI治疗累积临床妊娠率及活产率的报道。因此，本研究关注因男性因素接受助孕治疗患者的临床结局，并按女方年龄及获卵数不同分层对单个取卵周期累积临床妊娠率、累积活产率进行分析。研究结果显示，即使对于因男方因素接受ICSI助孕治疗的夫妇，女方助孕年龄仍然是决定ICSI治疗结局的关键因素，随着女方年龄的增加，获卵数、可利用胚胎数、累积临床妊娠率与累积活产率均呈下降趋势；40岁后平均移植优胚数下降，考虑与获卵数及卵子质量下降有关。Malizia等[7]对6 164例患者的14 248个取卵周期的活产率进行统计发现，IVF治疗可使绝大多数年轻女性获得活产，但不能逆转年龄所带来的妊娠率下降。De Neubourg等[8]对年龄进行分层后认为，年龄是累积活产率的直接影响因素，随着年龄的增加，累积活产率显著降低，从<35岁的62.9%降至35～37岁的51.4%，38～40岁为34.1%，41～42岁仅为17.7%。

一般认为，获卵数增加会带来可利用胚胎数增加，进而累积临床妊娠率及累积活产率相应升高。本研究中获卵数6～10枚、11～15枚及≥16枚组间比较，女方年龄、无可利用胚胎率、累积临床妊娠率及累积活产率均无显著性差异，但累积临床妊娠率及累积活产率随获卵数增加呈现增加的趋势；与之前文献报道的随获卵数增加累积活产率显著增加存在一定的差异，考虑与纳入病例数量有限有关[9]。同时我们发现获卵数为6～10枚时可获得较好的临床结局。过度增加获卵数会增加OHSS的风险[10-12]，继而增加患者的不适及经济负担。本研究结果也显示当获卵数≤5枚时，无可利用胚胎率显著增加，单个取卵周期平均移植胚胎数及移植优胚数明显下降，最终导致累积临床妊娠率及累积活产率显著下降，这与之前文献[7]结论相似，考虑可能与女性年龄增加有关。

本研究分析低反应(获卵数≤5枚)患者接受ICSI治疗发现，年轻患者(≤35岁)即使获卵数较少，单个取卵周期仍可获得33.33%的累积活产率，而高龄(>35岁)低反应患者累积活产率仅为8.33%，进一步提示ICSI治疗中女方年龄仍是最关键的因素。与Shi等[13]的结论相似，即正常反应与低反应年轻患者的累积活产率与种植率相似，而高龄患者即使获卵数较多，其临床结局亦不如年轻低反应患者。Xu[14]等的分析亦认为38岁之后低反应患者累积活产率明显低于<35岁患者，43岁之后累积活产率仅达到4.4%。另外，本研究对于低反应患者，若使用长方案或拮抗剂方案其获卵数≤3个而最终未获得妊娠者，或AFC≤3个者我们参考文献选择微刺激方案或黄体期促排卵方案治疗[15-16]，部分患者已获益并获得活胎分娩。

根据现有数据，我们初步认为获卵数相对较少的年轻女性即使合并男方严重少精子症也有望助孕成功，可建议及时积极助孕治疗；而高龄女性患者卵子质量下降，获卵数相对减少，合并男方精子严重异常时双方无法相互补救，无法获得高质量、发育潜能好的胚胎，容易导致助孕失败。

本研究中有8例(4.28%)男性患者伴有影响生育的染色体异常，其中7例(3.74%)为Y染色体微缺失患者；4例(50%)患者获得活胎分娩。这部分患者在接受ICSI治疗前已进行遗传咨询，告知相关遗传风险，建议考虑行PGT治疗，但因患者对于性别选择较为排斥，均要求行ICSI治疗。文献报道，男性原发无精子症和少精子症患者中约3%～15%存在Y染色体AZF区域微缺失，提示这可能是男性原发不育的一个重要遗传学病因[17]。有学者认为Y染色体微缺失患者有生育子代的可能[18]，此类患者可通过ICSI技术获得生育后代的机会，但由于Y染色体是单倍体，会垂直遗传给下一代，即进行ART治疗会将这种微缺失遗传给男性子代。本研究中1例Y染色体微缺失患者生育1男胎，意味着这种Y染色体微缺失通过ICSI技术传递给了下一代，很可能使下一代将来同样面临着不育的问题。另1例47，XY，+mar(额外小染色体)患者，在本中心助孕3周期，其中1周期移植获得妊娠后早期自然流产，之后未再获得临床妊娠。额外小染色体(extra small chromosome)，也称超数染色体(supernumerary chromosome)，是指一类多于正常染色体数(2N)的小染色体。群体细胞遗传学的研究证实，额外小染色体以一定的发生频率(0.2‰)存在于人类群体中[19]。Buekton等[20]对大范围人群进行筛选研究后发现生育力低下人群额外小染色体mar的发生率较高。mar对男性携带者生育力的影响较女性更为严重，我国也有少数文献报道其与男性严重精子异常及自然流产存在一定的关系[21-23]。

但因纳入数据样本量的限制，我们暂未将不同促排卵方案、不同时期胚胎等因素纳入比较，这也使数据基线统一性存在一定的限制，期待后续能通过多中心合作扩大数据样本量、矫正数据基线以进行更科学地数据分析。

综上，男方严重少精子症患者助孕结局仍然与女方年龄及获卵数有关，这与常规IVF治疗所获得的数据一致，对于男方因素引起的不育症建议夫妇双方尽早接受助孕治疗，以免错过最佳助孕时机，增加治疗费用及失败几率。对于合并影响生育的男性染色体异常患者，在接受助孕治疗前需给予充分遗传咨询，告知ART后可能面临自然流产、子代生殖健康等各类风险，并建议其尽量选择PGT治疗减少遗传风险。