自发性肥胖症雌性ob/ob小鼠糖脂代谢和卵泡超微结构的研究

张巧利，刘英，贾婵维，刘艳君，卜晓萌，王树玉

(首都医科大学附属北京妇产医院生殖医学科，北京 100026)

相关数据显示，截止2014年，全球有超过6亿成年人肥胖，其中女性占15%，是1980年数据的2倍多[1]。英国政府数据显示，1993至2012年女性重度肥胖的发病率由15%升至25%[2]；一项世界性调查发现我国女性肥胖的发病率为10%[3]，肥胖在育龄女性中越来越普遍。众所周知，肥胖会影响女性的月经和排卵[4]，可引起胰岛素抵抗，导致复发性流产等不良妊娠结局[5]，因此肥胖对女性生殖健康的影响是目前研究的热点。

肥胖和各种不健康的生活方式有直接关系，研究表明肥胖也可以多基因遗传，内生的DNA变异使得一些人群易感肥胖[6]。肥胖自发突变的纯合子小鼠(Lepob，通常为ob/ob)为自发性肥胖，背景为C57BL/6J，因瘦素(leptin)基因点突变导致leptin信号通路发生障碍，是自发性肥胖症动物模型。ob/ob小鼠出生大约4周时可看到表型，纯合子突变小鼠表现为体重迅速增加，可达野生型对照鼠正常体重的3倍。突变鼠除了肥胖以外还表现出摄食过量、糖尿病样高血糖综合征、生殖力降低，以及垂体和肾上腺激素水平升高。本文以ob/ob小鼠为研究对象，观察其糖和脂代谢，探索卵泡超微结构变化，以揭示人群中具有同样基因异常问题的自发性肥胖症女性的卵泡发育状况，为这类人群的生殖健康研究提供实验室依据。

材料与方法

一、实验动物与试剂

1.实验动物：15只4周龄雌性C57BL/6J小鼠(批号：XAJT2013-035)由西安交通大学动物实验中心提供，体重9.6～17.0 g；15只4周龄雌性ob/ob小鼠(批号：BCM059F2013-052)购自北京百奥赛图公司，体重20.5～30.5 g。小鼠饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。所有小鼠于SPF清洁级环境普通饲料饲养120 d，5只/笼，饲养环境为恒温20～25℃，相对湿度60%，12 h明暗周期，所有小鼠均自由进食和饮水，定期更换垫料，每隔2周用电子秤清晨9时测小鼠体重。动物实验获得西安交通大学医学院伦理委员会批准。

2.试剂与仪器：小鼠血清胰岛素(Insulin，INS)、雌二醇(E2)和睾酮(T)ELISA检测试剂盒购自美国ALPCO公司；四氧化锇购自英国Johnson Matthey Chemicals公司；环氧树脂购自美国SPI Supplies Division of Structure Probe公司；醋酸双氧铀购自加拿大Ted Pella公司；血脂检测试剂盒(甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇)购自上海盈公生物技术有限公司；血糖试纸购自上海强生制药有限公司；毛细玻璃管购自北京优尼康生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

LKB-Ⅴ型超薄切片机购自瑞典LKB公司；JEM-100SX透射式电子显微镜购自日本电子公司；IX70倒置显微镜和SZX9解剖镜购自日本Olympus公司；自动染色机、样品处理机购自德国Leica公司；多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司；台式低温高速离心机购自美国Thermo公司；MDF-382E超低温冰箱购自日本SANYO公司；强生血糖测试仪购自上海强生制药有限公司。

二、小鼠标本的获取

两组小鼠喂食100 d时进行葡萄糖耐受试验(GTT)，5 d后进行胰岛素释放试验(ITT)。两组小鼠喂食120 d时，禁食12 h，早晨先用血糖测试仪测空腹血糖(FBG)，之后采用苯巴比妥腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血获得血样，室温静置2 h，以3 000 r/min离心15 min，分离血清，-80℃冰箱冻存，后期进行INS、血脂和性激素(E2和T)检测。

小鼠摘眼球取血完毕，打开腹腔摘取双侧卵巢，剥离卵巢周围的脂肪组织，称量并记录。

三、小鼠糖代谢指标检测

1.葡萄糖耐受试验：对C57BL/6J小鼠和ob/ob小鼠进行GTT，小鼠禁食过夜(16 h)，按照2 g/kg体重的量腹腔注射葡萄糖，测0、30、60、90、120 min时的血糖。

2.胰岛素耐受试验：GTT试验5 d之后进行ITT，小鼠禁食4 h，按照0.75 U/kg体重的量腹腔注射胰岛素，测0、30、60、90、120 min时的血糖。

3.小鼠空腹血糖检测：两组小鼠喂食120 d于处死当天，禁食12 h，清晨使用血糖试纸收集小鼠剪尾后的血液进行FBG检测，在血糖测试仪上读数并记录。

4.小鼠胰岛素水平检测：按照小鼠胰岛素ELISA检测试剂盒说明书测定各组小鼠血清INS水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

四、小鼠血脂水平检测

采用酶法进行总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)测定，采用磷钨酸-镁沉淀法进行高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测，采用聚乙烯硫酸沉淀法检测低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，以上指标检测的操作步骤均按试剂盒说明书进行。

五、性激素水平检测

运用ELISA法检测两组小鼠血清标本E2和T水平。

六、小鼠卵巢组织透射电镜观察

将小鼠卵巢组织切成1 mm3的小块，置于2.5%的戊二醛固定液中4℃固定2 h以上(固定液内含有0.1 mol/L磷酸缓冲液、4%多聚甲醛)；0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗30 min，1%四氧化锇固定液4℃后固定2 h(固定液内含有0.1 mol/L磷酸缓冲液)，0.1 mol/L磷酸缓冲液浸洗10 min，乙醇梯度脱水(30%乙醇10 min，50%乙醇10 min，70%乙醇10 min)，70%乙醇醋酸双氧铀块染2 h或过夜；90%乙醇10 min×2次，100%乙醇10 min×3次，还氧丙烷置换10 min；环氧树脂Epon812浸透、包埋，聚合后作半超薄切片1～2 μm，美兰染色后光学显微镜下定位；超薄切片机进行超薄切片50～70 nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色；透射式电子显微镜下观察、拍照。

七、统计学分析

结 果

一、体重曲线变化

两组小鼠正常喂食120 d，体重曲线变化见图1。ob/ob组小鼠出生4周时体重显著高于对照组C57BL/6J小鼠(P<0.01)。此后直至喂食结束，ob/ob组小鼠体重每次测量均较对照组小鼠重，差异有统计学意义(P<0.001)。

与对照组比较，*P<0.01，#P<0.001图1 两组小鼠体重曲线变化

二、糖代谢指标比较

喂食120 d后，ob/ob小鼠的FBG、INS以及HOMA-IR均较对照组小鼠显著升高(P<0.05)(表1)。GTT和ITT试验显示，ob/ob小鼠血糖浓度分别在检测时间点0、30、60、90和120 min时均较对照组C57BL/6J小鼠显著升高(P<0.01)，而且GTT和ITT的AUC也均较对照组小鼠显著升高(P<0.001)(图2～5)。

表1 两组小鼠糖代谢指标的比较(-±s)

三、血脂水平比较

喂食结束后，ob/ob小鼠的血脂水平(TG、TC、HDL-C和LDL-C)均较正常对照组小鼠显著升高(P<0.05)(表2)。

与对照组比较，*P<0.01，#P<0.001图2 两组小鼠GTT曲线图

与对照组比较，*P<0.01，#P<0.001图3 两组小鼠ITT曲线图

与对照组比较，*P<0.001图4 两组小鼠葡萄糖耐受试验AUC

与对照组比较，*P<0.001图5 两组小鼠胰岛素释放试验AUC

表2 两组小鼠血脂水平的比较(-±s)

四、性激素和性腺脂肪的变化

与对照组C57BL/6J小鼠相比，ob/ob组小鼠血清T水平下降(P<0.05)，但E2水平无显著变化(表3)；ob/ob组小鼠卵巢周围脂肪组织(性腺脂肪)重量及其占体重的比列显著高于对照组(P<0.001)(图6、7)。

表3 两组小鼠性激素水平的比较(-±s)

与对照组比较，*P<0.001图6 两组小鼠性腺脂肪重量的比较

与对照组比较，*P<0.001图7 两组小鼠性腺脂肪重量/体重的比较

五、小鼠卵泡超微结构改变

对照组C57BL/6J小鼠卵泡超微结构表现：电镜下见到原始卵泡的卵母细胞核内染色质分布均匀，核仁可见，其周围可见单层扁平的卵泡细胞。初级卵泡及次级卵泡中的卵母细胞体积较大，细胞核较小，形状不规则(图A，10 000×)，核内常染色质丰富，核膜上的核孔清晰可见(图B，30 000×)。卵母细胞质内核糖体丰富(图C，30 000×)，滑面内质网呈板层或环形排列，线粒体呈圆形，细胞质内还可见到粗面内质网、高尔基复合体(图D，30 000×)及皮质颗粒；卵母细胞周围的颗粒细胞由单层变为多层，其间可见卵母细胞的微绒毛及颗粒细胞的突起(图E，30 000×)。卵母细胞和颗粒细胞，结构完整，透明带电子密度均匀(图F，3 000×)。

相较于对照组C57BL/6J小鼠，ob/ob小鼠原始卵泡中卵母细胞质内线粒体肿胀(图G，30 000×)；初级卵泡及次级卵泡中的卵母细胞核形状不规则，核内染色质疏松，核仁可见(图H，3 000×)；细胞质内细胞器不多，线粒体内灶状溶解且多呈高电子密度(图I，4 000×)。透明带电子密度和厚度不均匀，部分透明带溶解缺失，连续性中断(图J，10 000×)；卵母细胞周围的颗粒细胞排列紊乱，细胞多呈凋亡样改变(图K，4 000×)；颗粒细胞穿过透明带与卵母细胞靠近接触，透明带内颗粒细胞的突起消失(图L，4 000×)。

A～F为对照组小鼠；G～L为ob/ob小鼠。A：初级卵泡的卵母细胞核(箭头所示)可呈不规则形；B：卵母细胞的核膜可见清晰的核孔(箭头所示)；C：卵母细胞核糖体发达(箭头所示)，形态和数目正常；D：卵母细胞质内的高尔基体(红色箭头所示)形态规整，可见囊泡(白色箭头所示)；E：卵母细胞外围有丰富的微绒毛(箭头所示)伸入至透明带；F：颗粒细胞(箭头所示)形态规整，透明带厚度和电子密度均匀；G：原始卵泡中卵母细胞质内线粒体肿胀(箭头所示)；H：卵母细胞核形状不规则，核内染色质疏松(箭头所示)；I：线粒体内灶状溶解且多呈高电子密度(箭头所示)；J：部分透明带溶解缺失，连续性中断(箭头所示)；K：颗粒细胞排列紊乱，细胞多呈凋亡样改变(箭头所示)；L：透明带厚度不均匀，颗粒细胞穿过透明带与卵母细胞靠近接触(红色箭头所示)，透明带内颗粒细胞突起消失(白色箭头所示)图8 两组小鼠卵泡超微结构图像

讨 论

近20年来，我国超重或肥胖的人群患病率逐年增多，呈流行态势。中国健康营养调查数据显示[7]，从1993年到2009年的17年间，成人超重/肥胖的患病率从13.4% 增长至 26.4%，总体呈线性增长，自发性肥胖症的群体也越来越被关注。近30年来育龄女性超重和肥胖的患病率也呈显著上升趋势，肥胖除了影响女性月经外，还影响排卵、卵母细胞质量，胚胎发育以及子宫内膜容受性[8]。现有证据表明肥胖对下丘脑-垂体-卵巢轴和卵泡发育的影响程度与体重正相关[9]。研究认为胰岛素抵抗和氧化应激炎症是常见的影响介质[10]。

本研究显示自发性肥胖症ob/ob小鼠4周时体重便较对照组小鼠明显重，而且随着喂养时间延长，体重超重程度更为显著。尽管喂食正常饲料，喂食120 d时ob/ob小鼠糖代谢主要指标显著异常，出现空腹血糖升高、胰岛素抵抗，甚至发生糖尿病；同时主要血脂代谢指标也发生显著异常，ob/ob小鼠表现为代谢综合征(metabolic syndrome，MS)[11]。

理论上肥胖女性的高胰岛素血症和胰岛素抵抗会降低肝脏产生性激素结合球蛋白，导致循环中游离雄激素水平升高，阻碍卵泡的募集和排卵[12]。由于ob/ob小鼠糖脂代谢严重紊乱；卵巢超微结构发生显著异常改变；ob/ob小鼠卵巢周围的脂肪组织显著超标，脂肪组织可以分泌多种炎症因子[13]，以上因素严重损害了ob/ob小鼠卵巢功能，可能阻碍了卵巢T的合成。

卵泡的生长与成熟是通过FSH和 LH作用于颗粒细胞和卵泡膜间质细胞，并通过自分泌、旁分泌和胞内分泌及一系列信息传递和调节机制完成[14]。颗粒细胞与卵母细胞之间或颗粒细胞之间有许多缝隙连接，形成完整的功能联合体，颗粒细胞的突起和卵母细胞的微绒毛可深入透明带发生接触，有利于颗粒细胞将营养物质输送给卵母细胞以及细胞间离子、激素和小分子物质的交换，沟通信息，协调功能，从而调节卵母细胞的生长和发育。当受不良环境影响或相关基因发生异常时，卵母细胞及颗粒细胞的细胞器、数量、分布、结构、功能等均将发生相应改变。早些年学者已证实卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡过度密切相关[15]。本研究结果提示，ob/ob小鼠卵母细胞形态欠规则，细胞器出现损伤(线粒体为主)，颗粒细胞出现凋亡，部分卵母细胞核染色质排列紊乱；透明带形态或厚度异常；卵母细胞微绒毛明显减少。这些超微结构的改变使卵泡不能维持正常的形态结构和功能，最终影响机体的生殖健康。加之ob/ob小鼠存在严重的糖和脂代谢障碍，更加重了对生殖健康的负性影响。

自发性肥胖症ob/ob小鼠自幼体重超重，随着继续生长出现糖和脂代谢严重紊乱，出现代谢综合征，电子显微镜下观察到卵泡超微结构发生明显的病理损伤性改变，提示自发性肥胖症雌性个体存在严重的生殖健康问题。目前随着人类疾病谱的复杂化和生存环境的恶化，人群中这种由于基因缺失或突变的自发性肥胖症女性将会逐渐增多。本研究以小鼠模型为代表，对其代谢特征和卵泡超微结果进行初探，欲揭示这种基因异常对生殖健康的影响机制，期望伴随着医学科技的发展，能够开发出有效的干预方法，改善这个群体的生殖健康。