核桃楸皮总黄酮的体外抗氧化活性研究

闫明雪　王倩倩　杨铭哲　薛文静　史磊　赵盼

摘      要：為了研究核桃楸皮总黄酮的抗氧化活性和体外总还原能力，采用质量分数70%的乙醇回流提取核桃楸皮总黄酮，并用HPD-750型大孔树脂纯化核桃楸皮总黄酮;利用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法测定核桃楸皮总黄酮的质量浓度;通过DPPH自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和还原力实验研究核桃楸皮总黄酮的抗氧化活性和体外总还原能力。结果表明：提取物经HPD-750型大孔树脂纯化后所得的总黄酮粉末纯度为（72.02±4.01）%;核桃楸皮总黄酮对DPPH 自由基的半抑制质量浓度IC₅₀为2.068 ?g·mL^-1，对超氧阴离子自由基的半抑制质量浓度IC₅₀为273.253 ?g·mL^-1;还原力实验中，核桃楸皮总黄酮质量浓度为1 mg·mL^-1时吸光度为2.094 4;经统计学分析，核桃楸皮总黄酮的抗氧化活性与总黄酮质量浓度呈显著正相关（P<0.05）。体外抗氧化试验表明核桃楸皮总黄酮具有较好的体外抗氧化活性，以期为食品工业新型抗氧化剂、抗氧化食品以及抗氧化药物的研发提供理论依据。

关  键  词：核桃楸皮;总黄酮;提取纯化;抗氧化

中图分类号：R284       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）06-1051-05

Antioxidant Activity In Vitro of Total Flavonoids From Cortex Juglandis Mandshuricae

YAN Ming-xue， WANG Qian-qian， YANG Ming-zhe， XUE Wen-jing， SHI Lei， ZHAO Pan^*

（College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： To study the antioxidant activity and total reduction capacity in vitro of total flavonoids （TFs） from Cortex Juglandis Mandshuricae （CJM），TFs were extracted from CJM by 70% ethanol and purified by HPD-750 macroporous resin. The system of NaNO₂-Al（NO₃）₃-NaOH was used to determine the content of TFs from CJM. The antioxidant activity and total reduction capacity of TFs from CJM were studied by DPPH free radical scavenging experiments， superoxide anion radical scavenging experiments and reducing power experiments. The results showed that， after the extract was purified by HPD-750 macroporous resin， the content of TFs powder obtained was （72.02±4.01）%. The half inhibitory concentration （IC₅₀） of DPPH free radicals by TFs from CJM was 2.068 ?g·mL^-1， and the half inhibitory concentration （IC₅₀） of superoxide anion radicals was 273.253 ?g·mL^-1. In the reducing power experiment， the absorbance was 2.0944 when the TFs content from CJM was 1 mg·mL^-1. After statistical analysis， there was a significant positive correlation between the antioxidant activity and the content of TFs from CJM （P<0.05）. So TFs from CJM had good antioxidant activity in vitro. The paper can provide theoretical basis for the research and development of new antioxidants for antioxidant foods and antioxidant drugs.

Key words： Cortex Juglandis Mandshuricae; Total flavonoids; Extraction and purification; Antioxidant

核桃楸（Juglandis Mandshuricae）属胡桃科胡桃属植物，主要分布于我国东北、华北地区，是十分珍贵的药源植物，开发应用前景广阔^[1]。核桃楸皮（Cortex Juglandis Mandshuricae）为核桃楸的茎皮和枝皮^[2]，富含黄酮类、醌类、萜类、二芳基庚烷类、多酚类等多种化学成分^[3]，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等多种生物活性^[4]，在食品、药品等领域都具有较大的开发价值。

黄酮类化合物普遍存在于自然界中，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、调节免疫等多种药理活性^[5]，但目前针对核桃楸皮的研究多集中在醌类物质及抗肿瘤方面，对核桃楸皮总黄酮抗氧化活性的研究少见报道^[6-7]。因此，加快核桃楸皮总黄酮抗氧化活性的研究，对核桃楸皮的深度开发与利用具有重要的经济效益和社会效益。

1  试验

1.1  仪器

GFL-230型电热鼓风干燥箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;QE-300型高速粉碎机，浙江屹立工贸有限公司;FA1204B电子天平，上海天美天平仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司;DLSB-ZC型低温循环真空泵，郑州长城科工贸有限公司;YRE-501型旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司;KQ-500GVDV型双频恒温数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;LGJ-18型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司;UV9100B型紫外可见分光光度计 ，北京莱伯泰科仪器有限公司;TDL80-2B台式离心机，上海安亭科学仪器厂;PHS-25型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2  材料与试剂

核桃楸皮，安国市昌达中药材饮片有限公司;HPD-750型大孔树脂，沧州宝恩吸附材料科技有限公司;标准品芦丁，中国科学院成都生物研究所研制;抗坏血酸，天津市福晨化学试剂厂;亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、DPPH、无水乙醇、浓盐酸、邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁，均为国产、分析纯。

2  方法

2.1  芦丁标准曲线的绘制

绘制芦丁标准曲线采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色法，参考李学玲^[8]等的方法稍做改变。取2 mL 200 ?g·mL^-1芦丁标准溶液置于10 mL容量瓶中，加入质量分数为5% 的NaNO₂ 溶液0.5 mL，摇匀后静置8 min;再加入质量分数为10% 的Al（NO₃）₃ 溶液0.5 mL，摇匀后静置6 min;然后加入质量分数为4% 的NaOH溶液4.0 mL，质量分数为70%的乙醇定容，摇匀后放置10 min，以不加芦丁标准溶液为空白调基线，用紫外分光光度计在200～800 nm内进行光谱扫描，确定其最大吸收波长为510 nm。光谱扫描如图1所示。

准确量取芦丁标准溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，按上述操作步骤进行显色反应，以不加芦丁标准溶液为空白，在510 nm处测量吸光度。绘制芦丁标准曲线如图2所示。

2.2  核桃楸皮总黄酮的提取

参考何微^[9]等的总黄酮提取工艺稍做修改。将干燥至恒重的核桃楸皮粉碎，过100目筛（孔径  0.15 mm）得核桃楸皮粉末307.7 g，加入15倍量质量分数为70%的乙醇，在80 ℃水浴下回流提取  1.5 h，提取两次。将提取液抽滤，合并两次滤液，得核桃楸皮粉末的醇提液。将醇提液用旋转蒸发仪在60 ℃下减压回收乙醇至无醇味，即得。

2.3  核桃楸皮总黄酮的纯化

大孔吸附树脂具有物理化学稳定性高、吸附容量大、吸附速度快、选择性好、再生处理方便等优点，被广泛应用于中草药化学成分的提取、分离、纯化工作中^[10]。大孔吸附树脂的吸附性是其与被吸附物质分子间的范德华力以及形成氢键而产生的，即一种通过巨大的比表面积而进行的物理吸附。由于提取液中的化学成分复杂繁多，分子量和吸附力各不相同，因此被吸附成分经过一定的溶剂洗脱，可以先后从大孔树脂上被洗脱下来，达到分离、纯化物质的目的^[11]。本实验经过前期实验，选用HPD-750型大孔树脂对核桃楸皮总黄酮进行纯化。控制上样质量浓度约5 mg·mL^-1，样液以2 BV/h的流速流过树脂柱，最大上樣量7 BV，静置，吸附4 h后用蒸馏水淋洗树脂柱至流出液澄清，再用8 BV体积的质量分数为70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液。

2.4  核桃楸皮总黄酮粉末的制备

将核桃楸皮总黄酮纯化后的洗脱液在60 ℃下减压旋蒸，得到核桃楸皮总黄酮浓缩提取液，经冷冻干燥后得核桃楸皮总黄酮粉末31.70 g。

2.5  总黄酮粉末纯度的测定

取黄酮粉末5.3 mg，用质量分数为50%的乙醇定容到25 mL容量瓶中，得到总黄酮溶液。移取5 mL总黄酮溶液于25 mL容量瓶中，加入质量分数为5% 的NaNO₂溶液0.5 mL，摇匀后静置8 min;再加入质量浓度为10%的 Al（NO₃）₃ 溶液0.5 mL，摇匀后靜置6 min;然后加入质量分数为4% NaOH溶液4.0 mL，质量分数为50%的乙醇定容，即得待测样品。以质量分数为50%的乙醇为空白，在510 nm处平行3次测得吸光度为0.424 4±0.009 2，利用工作曲线计算样品质量浓度为（30.53±1.70）?g·mL^-1。最终计算得到核桃楸皮总黄酮粉末的纯度为（72.02±4.01）%。

式中：C —待测样品的质量浓度，?g·mL^-1;

V — 待测样品的体积，mL。

2.6  对DPPH自由基的清除率测定

参考杨永涛^[12]的方法，并稍加修改。精确称量黄酮粉末0.013 9 g，质量分数为50%的乙醇定容到100 mL容量瓶中，得质量浓度为100 ?g·mL^-1的核桃楸皮总黄酮溶液，分别量取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL总黄酮溶液于25 mL容量瓶中，质量分数为50%的乙醇定容，得到质量浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16 ?g·mL^-1的核桃楸皮总黄酮溶液。分别取上述不同质量浓度溶液   2 mL，置于8个10 mL比色管中，然后分别加入        0.1 mmol·L^-1 DPPH溶液2 mL，混合摇匀，37 ℃水浴下避光放置30 min后，于517 nm处测定吸光度值A_x，以2 mL无水乙醇代替DPPH溶液，测得吸光度A₁，以2 mL无水乙醇代替样品溶液，测得吸光度 A₀。每一吸光度平行测定3次，取平均值。以相同质量浓度的VC作阳性对照。以质量浓度为横坐标，对DPPH自由基的清除率为纵坐标，绘制工作曲线。对DPPH自由基的清除率计算公式如下：

2.7  对超氧阴离子自由基（O₂^-·）的清除作用测定

参考单科开^[13]等的方法，采用邻苯三酚自氧化法，取4.5 mL质量浓度为50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液（pH=8.2）于10 mL比色管中，加入4 mL蒸馏水，均匀混合后于28 ℃条件下水浴20 min。随后快速加入在28 ℃水浴中预热的3 mmol·L^-1邻苯三酚溶液0.5 mL，迅速摇匀倒入比色皿中，用10 mmol·L^-1 HCl溶液作为空白调零，于325 nm波长处每间隔30 s测量该溶液的吸光度值，共测量4 min，以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制线性回归曲线，其斜率即为邻苯三酚的自氧化速率V₀。用4 mL质量浓度分别为20、40、60、80、100 ?g·mL^-1的核桃楸皮总黄酮溶液代替4 mL蒸馏水，按照同样的方法绘制线性回归曲线，其斜率记为V_x。对超氧阴离子自由基的清除率计算公式如下：

2.8  总还原力的测定

参考冯小雨^[14]等的方法测定核桃楸皮总黄酮的总还原能力。配制质量浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·mL^-1的核桃楸皮总黄酮醇溶液，分别取1 mL放入5个离心管中，再在每个离心管中各加入2.5 mL 0.2 mol·L的磷酸盐缓冲液（pH=6.6）与2.5 mL 质量分数为1 %的铁氰化钾溶液，混匀后在50 ℃条件下水浴30 min，再加入2.5 mL 质量分数为10%三氯乙酸，并在5 000 r·min^-1的条件下离心10 min，分别取2.5 mL上清液于5个比色管中，依次加入2.5 mL蒸馏水与0.5 mL 质量分数为0.1%的三氯化铁溶液，反应10 min后，以蒸馏水为空白调零，在700 nm波长处测吸光度值，平行测定3次，以相同质量浓度的 VC 为阳性对照。

2.9  数据处理

利用SPSS 22软件计算核桃楸皮总黄酮和VC对自由基清除能力的IC₅₀，利用Pearson法进行抗氧化活性与总黄酮质量浓度的相关性分析。

3  结果与分析

3.1  核桃楸皮总黄酮清除DPPH自由基能力

DPPH自由基在乙醇溶液中呈紫色，在517 nm波长处有最大吸收，其吸光度与质量浓度呈正相关，当在其中加入抗氧化物质时，抗氧化物质会与DPPH自由基发生反应，使自由基的数量减少，溶液颜色变浅，在最大吸收波长下的吸光度降低。因此抗氧化能力越强，DPPH溶液在517 nm处吸光度越小，抗氧化物质对DPPH自由基的清除率越高^[15]。核桃楸皮总黄酮对DPPH自由基的清除率如图3所示。

核桃楸皮总黄酮和VC的自由基清除能力IC₅₀值如表1所示。核桃楸皮总黄酮对DPPH自由基的半抑制质量浓度IC₅₀值为2.068 ?g·mL^-1，VC对DPPH自由基的半抑制质量浓度IC₅₀值1.911 ?g·mL^-1。当质量浓度达到16 ?g·mL^-1时，VC 对DPPH自由基的清除率可达到96.30%，核桃楸皮总黄酮对DPPH自由基的清除率可达到93.27%，这说明核桃楸皮总黄酮具有显著的清除DPPH自由基的能力。

3.2  核桃楸皮總黄酮清除超氧阴离子自由基能力

邻苯三酚在弱碱性条件下会发生自氧化，生成超氧阴离子自由基以及有色中间体，该有色中间体在325 nm处有最大吸收。若加入抗氧化物质，将会清除超氧阴离子自由基，阻碍有色中间体的积累，因此可以通过溶液在325 nm下吸光度值的变化反映核桃楸皮总黄酮清除超氧阴离子自由基的能力^[16]。核桃楸皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率如图4所示。

核桃楸皮总黄酮对超氧阴离子自由基的半抑制质量浓度IC₅₀值为273.253 ?g·mL^-1，高于VC对超氧阴离子自由基的半抑制质量浓度IC₅₀值41.299 ?g·mL^-1。在20～100 ?g·mL^-1的质量浓度范围内，VC 对超氧阴离子的清除率最高可达到97.71%，而核桃楸皮总黄酮对超氧阴离子的清除率最高为23.08%，说明核桃楸皮总黄酮具有一定的清除超氧阴离子自由基的能力，但弱于阳性对照 VC。

3.3  核桃楸皮总黄酮的总还原能力

抗氧化物质具有还原能力，当在体系中加入抗氧化物质时，[Fe（CN）₆]^3- 会被还原成 [Fe（CN）₆]^4-，酸性条件下，Fe³⁺ 与 [Fe（CN）₆]^4- 反应生成深蓝色的沉淀，被称为普鲁士蓝（Fe₄[Fe（CN）₆]₃）。普鲁士蓝在700 nm处有最大吸收，其吸光度可以衡量普鲁士蓝的质量浓度，进而表示还原能力，以还原能力来反映物质的抗氧化活性，即吸光度越大，抗氧化能力越强^[17]。核桃楸皮总黄酮的总还原能力如图5所示。

在考察质量浓度范围内，随着质量浓度的增大，核桃楸皮总黄酮的总还原能力增强，即总黄酮质量浓度与总还原能力之间有显著的正相关性（P<0.05）。当质量浓度增大到1 mg·mL^-1时，VC 的吸光度为2.345 9，核桃楸皮总黄酮的吸光度为2.094 4，即核桃楸皮总黄酮具有良好的总还原能力。

3.4  核桃楸皮总黄酮的质量浓度与清除自由基能力的相关性分析

核桃楸皮总黄酮的质量浓度与清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基能力的相关性分析如表2所示。通过Pearson分析，核桃楸皮总黄酮的质量浓度与其清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的能力存在显著正相关，即核桃楸皮总黄酮的质量浓度越高，其清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基的能力越强，量效关系明显。

4  结束语

本研究利用乙醇加热回流提取核桃楸皮中的总黄酮，利用HPD-750 型大孔吸附树脂纯化总黄酮，得到的核桃楸皮总黄酮粉末纯度为（72.02±4.01）%。利用 DPPH法检测核桃楸皮总黄酮清除 DPPH 自由基的能力，在设置的质量浓度梯度中，核桃楸皮总黄酮对 DPPH自由基的清除力随着核桃楸皮总黄酮质量浓度的增大而增大，与阳性对照 VC 对比，清除能力显著;利用邻苯三酚自氧化法检测核桃楸皮总黄酮清除超氧阴离子自由基的能力，在设置的质量浓度梯度中，核桃楸皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除力随着核桃楸皮总黄酮质量浓度的增大而增大，与阳性对照 VC 对比，其具有一定的清除能力。经相关性分析，核桃楸皮总黄酮的清除自由基的能力与总黄酮质量浓度呈显著正相关（P<0.05）。利用普鲁士蓝法检测核桃楸皮总黄酮的总还原能力，总还原能力随着核桃楸皮总黄酮质量浓度的增大而增大，在0.50～1.00 mg·mL^-1的质量浓度范围内，核桃楸皮总黄酮表现出显著的总还原能力。综上所述，核桃楸皮总黄酮具有良好的抗氧化性。

本试验结果证明，核桃楸皮总黄酮具有较好的抗氧化作用，可以作为良好的抗氧化剂。由于中药的抗辐射损伤可以通过抗氧化作用实现，因此研究具有抗氧化作用的中药成分逐渐成为医疗和保健品行业的热点问题^[18]，本实验研究结果可为核桃楸皮总黄酮在抗氧化新药的研发、功能性保健品的开发等方面提供理论支持。

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