正交法优化参苓白术散总黄酮的提取工艺
2020-08-24王悦王娅玲邹婧陶然高世杰
王悦 王娅玲 邹婧 陶然 高世杰
摘 要：目的 为深入研究参苓白术散现代临床功效，以确保药效的发挥，本试验进行参苓白术散总黄酮质量分数测定，正交试验筛选最佳提取方案。方法 设计单因素试验，以乙醇的质量分数、用量和提取时间为优化条件，测定参苓白术散中黄酮的质量分数，并对提取工艺进行优化。结果 参苓白术散总黄酮的最优试验提取工艺：乙醇质量分数为50%，提取时间 2 h，乙醇用量 25 mL。
关 键 词：参苓白术散;总黄酮;乙醇提取;正交试验法
中图分类号：R284 文献标识码： A 文章编号： 1671-0460（2020）06-1039-04
Orthogonal Method was used to Optimize the Extraction Process of Total Flavonoids From Shenling Baizhu Powder
WANG Yue， WANG Ya-ling， ZOU Jing， TAO Ran， GAO Shi-jie
（School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）
Abstract： Objective To study the modern clinical efficacy of Shenling Baizhu Powder in depth to ensure the effectiveness of the drug. This experiment was used to determine the total flavonoid content of Shenling Baizhu Powder， and the process was optimized by orthogonal method to screen the best extraction scheme. Methods A single-factor experiment was designed to determine the content of flavonoids in the Shenling Baizhu Powder and to optimize the extraction process， with ethanol concentration， ethanol dosage and extraction time. Results The best extraction process for total flavonoids in Shenling Baizhu Powder is： 50% ethanol concentration， 25 mL of ethanol， extraction time of 2 h.
Key words： Shenling Baizhu Powder; Total flavonoids; Ethanol extraction; Orthogonal experimental method
參苓白术散为古籍医方，临床应用历史悠久。全方由莲子肉、桔梗、白扁豆、人参、甘草等组成[1]，能够益脾和胃、生清降浊、安胎固神，多用于治疗脾胃虚弱、舌苔白腻、胸脘痞塞等常见疾病[2]。本方药性温和，具有很好的健脾作用，人参、茯苓、白术共用为君辅以山药、白扁豆等增强利水渗湿的作用。
该方配伍灵活，功效显著。茯苓具有安神定惊、调和脾胃的功效[3]，在治疗脾虚、痰饮、湿热、带下等方面功效显著，“十药九茯苓”便是说茯苓在复方配伍中十分常见[4];人参为贵重中药，药性温和，能够补益元气[5]、延缓衰老、安神定惊[6]，具有安神固元、延年益寿的作用;白术能够利水渗湿、止汗安胎[7]，能够调节脾胃运动、增强免疫、降脂等，三者共用为君以增强参苓白术散的功效。
与中药抗肿瘤、抗菌等方面的研究相比，中药抗氧化方面的研究仍较为薄弱[8]，因此该试验采用正交法优化参苓白术散中总黄酮的提取条件，通过常温下测定的吸光度计算总黄酮含量，可为参苓白术散总黄酮体外抗氧化活性及其机制的研究提供试验依据。
1 试验
1.1 材料
1.1.1 药材
参苓白术散粉末（市售，经鉴定）。
1.1.2 试剂
芦丁对照品，三氯化铝，乙醇等均为分析纯。
1.1.3 仪器
高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技有限公司）;可见分光光度计;远外红辐射干燥箱;循环式真空泵;电子天平[9]。
2 试验过程
2.1 标准曲线绘制
取芦丁标准品 0.02 g，加入乙醇密封超声助溶，移液枪依次取对照品溶液加到试管中，各自加30%乙醇稀释至 5 mL，依次加入 0.3 mL 5%的亚硝酸钠，震荡;再加0.6 mL 10%三氯化铝;然后加2 mL 4%氢氧化钠，用30%乙醇稀释，摇匀，静置15 min，于 510 nm处测其吸光度[10]。
2.2 参苓白术散待测液
精密称量参苓白术散约 1.00 g，向其中加入定量乙醇，采用乙醇回流的方法回流2 h，离心，倾出上清液，定容备用。
2.3 质量分数测定
将上述制备好的溶液备用，参照芦丁标准曲线的制備方式，测定参苓白术散中总黄酮的吸光度，于常温下进行，带入标准曲线中，计算参苓白术散中总黄酮的质量分数。
2.4 单因素试验
本试验以参苓白术散复方为试验材料，以最终黄酮得率为指标进行试验，对乙醇的用量、质量分数和提取时间三个变量进行试验。
2.5 正交试验
采取乙醇质量分数、乙醇用量、提取时间 3 个因素，在每个因素中挑选 3 个水平，开展正交试验，以参苓白术散中总黄酮提取量为考核标准，见表1 。
3 结果分析
3.1 标准曲线测定
如图1所示， 绘制吸光度-芦丁溶液的表达式，得回归方程：Y = 8.705x- 0.01，R2= 0.999 2。
3.2 单因素试验
3.2.1 乙醇浓度
由图 2 可知，黄酮的提取受乙醇质量分数的影响较为明显，在乙醇质量分数40%～60%梯度内呈开始上升然后下降的变化，乙醇质量分数为 50%时得到的黄酮最多，乙醇质量分数的逐渐升高抑制了黄酮的提取，可能原因为高质量分数乙醇在常温下极易挥发，浓度越高挥发效果越强，主要成分乙醇挥发在空气中。
3.2.2 乙醇用量
由图 3 可知，总黄酮质量分数测定过程中乙醇的最大用量为 30 mL，在试验用量范围内，总黄酮得率一直呈上升趋势，受试验条件和实际应用中节省材料考虑，选择乙醇用量为 30 mL。
3.2.3 提取时间
根据图 4 ，当提取时间变长时，总黄酮质量分数表现出先逐渐升高，黄酮质量分数在2.5 h 时最大，提取最充分，而后降低。回流时间过长易导致其有效成分的破坏，并且其他物质的溶出易导致提取的黄酮掺杂。
3.3 正交试验结果
此试验查核了乙醇的用量、质量分数、提取时间共三个变量对试验结果的作用，设计正交试验，记L9（34），见表 2。方差结果分析见表3。
由表2 、表3可以看出，三个因素之间，乙醇质量分数对参苓白术散中黄酮的提取影响最大，其次，乙醇用量的作用较次之，对提取时间来说，它的极差最小，作用最不显著，对最后的结果影响最低。另外，对比乙醇质量分数各水平为K1>K2>K3，表示这三个水平中，用 50%乙醇较好;乙醇用量各水平比较是K3>K2>K1，所以选择 25 mL 乙醇用量较优;在时间方面，其每水平之间比较为K2>K1>K3，能够看出2 h 为最佳提取时间。综上，最佳提取工艺组合为：A1 B3 C2。
3.4 结果
据以上正交试验结果，按优选出的试验条件进行重复性试验，以黄酮提取量为指标，结果见表 4。
4 讨论
现代临床试验证明参苓白术散具有调节人体免疫功能、减少感染、促进肠道蠕动的作用。李姿
慧[11]等结合大鼠试验表明参苓白术散在治疗溃疡性结肠炎方面作用显著，疗效突出，能够减少泻下，缓解大便溏薄症状[12];李烜运用参苓白术散治疗中晚期胃癌能够有效减少肿瘤恶化，减少病灶转移，减轻患者痛苦;雷远忠[13]对参苓白术散配方进行加减调和，发现对于脾虚型哮喘具有较好的治疗效果，气喘现象减少，呼吸更加顺畅，发作频率也逐渐减少。
现今，已知的提取黄酮类化合物的方法以酶辅助提取法[14]、溶剂提取法[15]、超声辅助提取法[16]、超临界CO2萃取法[17]、微波辅助提取法[18]为主，除此之外，还有多种方法需要我们去探索。本试验采用有机溶剂提取法，以乙醇促进黄酮溶出。采用乙醇回流提取能够使参苓白术散中乙醇溶解更充分。通过将乙醇作为溶剂，对其不同浓度、用量以及提取时间考察，把参苓白术散总黄酮作为衡量标准，设计正交试验，最终确定组方中总黄酮的最优提取方案：乙醇质量分数为50%，乙醇用量为 25 mL，提取时间为2 h，为今后中药组方的抗氧化方面的研究奠定良好的基础。
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