不同的样品制备方法对壳聚糖创伤敷料细胞毒性实验结果的影响

刁立琴，康莉，付钊，高保栓，王亚茹

河北省医疗器械与药品包装材料检验研究院 （河北石家庄 050227）

壳聚糖创伤敷料是以壳聚糖为主材料制造成的一种生物产品，具有抑菌消炎、止血止痛、促进创面愈合、滋养修复黏膜、免疫调节活性的作用。壳聚糖创伤敷料作为一种新型的创伤敷料，已经逐步取代传统敷料，广泛用于临床创伤和伤口的愈合。

细胞毒性实验是进行生物学评价的重要检测指标。GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》是最新的国家标准，其中MTT 法是目前常用的细胞毒性检测方法。由于该标准仅规定了共性的实验方法，并没有明确规定如何选择合理的样品制备方法，因此，针对壳聚糖创伤敷料这类可溶性产品，本研究结合YY 0953-2016 《医用羧甲基壳聚糖》的行业标准，进行了一系列的对比实验，以探讨不同的样品制备方法对壳聚糖创伤敷料细胞毒性实验结果的影响。

1 材料与方法

1.1 一般材料

材料：壳聚糖创伤敷料，阳性对照材料为20%的二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO），阴性对照材料为高密度聚乙烯。

细胞：小鼠成纤维细胞L-929（中国科学院上海生命科学院细胞资源中心）。

主要试剂：1640培养基（北京Solarbio生物科技有限公司）；MEM培养基[赛默飞世尔（苏州）仪器有限公司]；胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd）；DMSO（SIGMA-ALDRICH）；异丙醇（天津市百世化工有限公司）；高密度聚乙烯膜（Hatano Research Institute，FDSC）；0.9%氯化钠注射液（石家庄四药有限公司）；MTT（Sigma公司），溶于不含酚红的MEM中，浓度为1 mg/ml，溶液采用过滤器（孔径≤0.22 μm）经无菌过滤法除菌，过滤后当天使用。

1.2 方法

材料浸提液制备（表1）：将样品按不同的浸提介质和浸提比例分为1～4组，其中按6 cm2/ml 加入含10%胎牛血清的MEM 培养基，在5% CO2培养箱中37 ℃浸提24 h 后作为浸提液1组；同法以含10%胎牛血清的1640培养基和0.9%氯化钠注射液制备浸提液2组和浸提液3组；每组设置100%浸提液和50%浸提液，分别标示为1a 组、1b 组、2a 组、2b 组和3a 组、3b 组[1]。将样品按2 mg/ml 的比例加入含10%胎牛血清的MEM 培养基，在5% CO2培养箱中37 ℃浸提24 h 后作为浸提液4组[2]。

对照材料浸提液制备。阴性对照液：取高密度聚乙烯膜按表面积3 cm2/ml 的比例加入含10%胎牛血清的MEM（1640或0.9%氯化钠注射液）培养基，在5% CO2培养箱中37 ℃浸提24 h。阳性对照液：20%的DMSO。

表1 浸提液制备分组

细胞毒性实验方法：将1×105/ml 细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μl；置5% CO2培养箱中37 ℃培养24 h 后，弃去原培养液；加入样品浸提液、空白对照液、阴性对照液和阳性对照液，每孔100 μl 置CO2培养箱中37 ℃培养24 h；除去原培养液，每孔加入50 μl MTT 溶液；继续培养2 h 后除去孔内MTT 溶液，加入100 μl 异丙醇，振荡10 min，在酶标仪570 nm 和650 nm 双波长下测定吸光度（OD 值），按下式计算存活率：

存活率（%）=（100×OD570e）/ OD570b

注： OD570e为实验样品组（阴性、阳性对照组）吸光度平均值，OD570b为空白对照组吸光度平均值[3]。

2 结果

细胞存活率结果显示，3a组（80%）＞1a组（69%）＞2a组（18%）；4组（93%）＞1a组（69%），表明壳聚糖创伤敷料在不同的浸提介质和浸提比例下，细胞毒性结果差异显著，见表2～5。

表2 GB/T 16886.5-2017 MTT 法实验结果（MEM 组，6 cm2/ml）

表3 GB/T 16886.5-2017 MTT 法实验结果（1640组，6 cm2/ml）

表4 GB/T 16886.5-2017 MTT 法实验结果（0.9%氯化钠注射液组，6 cm2/ml）

表5 GB/T 16886.5-2017 MTT 法实验结果（MEM 组，2 mg/ml）

3 讨论

表2～4结果显示，壳聚糖创伤敷料在其他方法相同，仅浸提介质不同的情况下，细胞存活率结果出现显著差异，0.9%氯化钠注射液组＞MEM 组＞1640组。我们分析认为，壳聚糖创伤敷料在3种浸提介质中都能很好地溶解，0.9%氯化钠注射液的成分相对单一，而1640和MEM 中含有多种氨基酸和葡萄糖等，成分相对复杂，在和样品浸提的过程中，可能因不同成分和样品相互作用，甚至发生反应，导致最终的浸提液差异，因此，不能简单以细胞存活率的高低来判定哪种浸提介质是适宜的，应结合临床实际应用，模拟创面体液环境，才能保证评价结果的临床预期。

表2～5结果显示，浸提介质均选择含10%胎牛血清的MEM，按2 mg/ml 浸提比例的细胞存活率结果明显高于按6 cm2/ml 浸提比例的结果。按GB/T 16886.12-2017中规定选用面积比，根据产品厚度＜0.5 mm，选择6 cm2/ml；同时，YY 0953-2016标准中6.18.2规定，可用0.9%氯化钠注射液配制成含羧甲基壳聚糖2 mg/ml 溶液作为实验液。对比2 mg/ml 和6 cm2/ml 浸提比例，按质量/体积同等换算为面积/体积比，浸提液相当于稀释了8倍，虽然得到的细胞存活率结果较高，但是否与实际应用一致有待考证。

GB/T 16886.12-2017中规定，有质量比为0.2 g/ml 和0.1 g/ml 两种浸提比例。但是，对于壳聚糖创伤敷料这种可溶性产品，这两种浸提比都难以使产品充分溶解，无法获取浸提液，显然这两种浸提方法都不适用此类产品，因此，从临床应用情况考虑，我们认为采用面积比更加贴合实际。

实验样品的前期制备对结果起着关键作用。GB/T 16886.12-2017虽然给出了样品制备的原则，却是对医疗器械的通用要求，针对具体品种，需要实验者或者企业自己选择。从本研究结果可知，对于壳聚糖创伤敷料这类产品，不同的样品制备方法在同一实验室内结果差异显著，而且针对其可溶性这类特性，因为没有统一的制备方法，即使相同的产品在不同的实验室间也会出现很大差异，这不仅不利于国家对同类产品的监管评判，也对现有的标准方法提出了挑战。随着市场上医疗器械产品日益丰富，材质特性日益多元化，我们认为，有必要根据医疗器械产品特性，制定相关的产品标准，才能保障产品的安全有效。