冲泡条件对玫瑰茄花青素及总黄酮溶出量的影响

黄晓辰，马金魁，梁乐欣，冯润香

（肇庆学院食品与制药工程学院，广东肇庆526061）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名洛神花，是一种一年或多年生的锦葵科木槿属植物，广泛分布于热带及亚热带地区的国家，是一种传统的药食两用植物，其茎、叶、花和种子皆可加以利用[1]。嫩叶或茎常用于制作沙拉、酸辣酱或配料[2-3]；种子含丰富的蛋白质，可用于煮汤、榨油或发酵后用于调味[1]；花则被广泛应用于果冻、果酱、葡萄酒等各种食品及饮料的加工[4-6]。玫瑰茄花萼为杯状肉质结构[7]，颜色为紫红色，含丰富的碳水化合物、膳食纤维、蛋白质、维生素、矿物质和多种生物活性物质，如有机酸、植物甾醇、多酚类化合物、花青素、多糖等[1，8]。现代药理研究表明，玫瑰茄花提取物具有降压减脂[9-10]、抗菌消炎[11-12]、抗癌[13]、预防贫血[14]、治疗镉中毒[15]等生理作用。

黄酮类化合物广泛存在于植物体中，是一类次级代谢产物，具有很强的抗氧化作用，可降低心血管疾病的发病率、防癌消炎、调节免疫[16]。玫瑰茄花中含丰富的黄酮类化合物，包括花青素、黄酮、黄烷酮、黄酮醇、黄烷醇和异黄酮，其中花青素是玫瑰茄抗氧化作用的主因[1]。花青素是一类水溶性天然色素，是许多植物体的主要呈色物质，因不同植物中的细胞液酸碱度不同，而呈现不同的颜色[17]。研究表明，玫瑰茄花中的花青素主要是飞燕草素-3-桑布双糖苷、矢车菊素-3-桑布双糖苷、飞燕草素葡萄糖苷和矢车菊素葡萄糖苷[1]。

随着消费者保健意识的觉醒和大健康时代的到来，花茶成为更多人群的健康选择。玫瑰茄花茶因其独特的风味、色泽和天然的保健功能而备受青睐。我国对玫瑰茄的研究起步较晚，现阶段，针对玫瑰茄花的研究主要集中于其活性组分提取及药理作用的探索，而有关日常生活中玫瑰茄花茶的冲泡及其活性成分溶出的研究寥寥无几。研究冲泡条件对玫瑰茄花青素和黄酮类化合物溶出的影响，将有助于玫瑰茄系列健康食品的研发，提高其资源利用率。本研究利用正交试验方法优化玫瑰茄花茶的冲泡条件，以期为玫瑰茄花茶的合理冲泡和饮用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰茄干花萼，无虫害且无腐烂霉变，产地云南。将玫瑰茄花萼置于45℃干燥过夜，于-18℃密封存储，待用。

无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠：均为分析纯，西陇科学股份有限公司；氯化钾、盐酸、三水合乙酸钠、九水合硝酸铝：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；芦丁标准品（LE70R58）：上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

V-1100D可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；BSA124S-CW电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；DHG-9145A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；HHS-21-6电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；TDL-60B低速台式离心机：上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

准确称取一定量的玫瑰茄干花萼样品于烧杯中，在设定的冲泡时间、冲泡温度、茶水比参数下，冲泡1次，过滤，待滤液冷却至室温（26℃）后，定容，即得玫瑰茄花茶茶汤样品。

1.3.1 玫瑰茄冲泡条件的单因素试验

1.3.1.1 影响玫瑰茄花青素溶出量的单因素研究

称取1 g玫瑰茄样品，分别固定冲泡温度70℃、茶水比1∶40（g/mL）、冲泡时间25 min的条件下，研究不同冲泡时间（20、25、30、35、40 min）、不同冲泡温度（60、70、80、90、100℃）、不同茶水比[1 ∶20、1 ∶30、1∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]对玫瑰茄茶汤内花青素溶出量的影响。

1.3.1.2 影响玫瑰茄总黄酮溶出量的单因素研究

称取1 g玫瑰茄样品，分别固定冲泡温度70℃、茶水比1∶50（g/mL）、冲泡时间30 min的条件下，研究不同冲泡时间（20、25、30、35、40 min）、不同冲泡温度（60、70、80、90、100℃）、不同茶水比[1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）]对玫瑰茄茶汤内总黄酮溶出量的影响。

1.3.2 玫瑰茄冲泡条件的正交试验

依据单因素试验结果，以冲泡时间、冲泡温度、茶水比为试验因素，进行L9（33）正交试验，研究冲泡时间、冲泡温度、茶水比对玫瑰茄花茶茶汤内花青素、总黄酮溶出量的影响。花青素溶出的正交试验因素水平表见表1。

表1 花青素溶出的正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test regarding anthocyanins in roselle tea

总黄酮溶出的正交试验因素水平表见表2。

表2 总黄酮溶出的正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test regarding flavonoids in roselle tea

1.3.3 玫瑰茄茶汤中花青素溶出量的测定

参考Amaya-Cruz等[18]的方法，略作修改，依据pH示差法的原理测定玫瑰茄茶汤内花青素的含量。称取一定量的玫瑰茄样品，用热水冲泡一定时间后，过滤，移取2 mL滤液于10 mL容量瓶中，分别用pH 1.0、pH 4.5的缓冲溶液定容，在40℃水浴中反应平衡50 min。以蒸馏水作空白对照，分别在520 nm和700 nm处测定花青素的吸光值，选用矢车菊-3-葡萄糖苷作为计量标准，利用Fuleki公式对玫瑰茄茶汤中花青素的溶出量进行计算。

式中：△A为花青素总吸光值；V为提取液总体积，mL；k为稀释倍数；M为Cy-3-Glu（矢车菊-3-葡萄糖苷）的相对分子质量，449.2 g/mol；ε为Cy-3-Glu的消光系数，26 900 L/（mol·cm）；m为样品质量，g；L为光程，数值为1 cm。

1.3.4 玫瑰茄茶汤中总黄酮溶出量的测定

标准曲线的绘制：参照范金波等[19]的方法，略作修改。准确称取芦丁标准品10 mg，用80%乙醇溶解、定容至50 mL，得浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别移取 1、4、8、12、16 mL 芦丁标准溶液于 50 mL 容量瓶中，加入5%的亚硝酸钠溶液1.4 mL，混匀静置6 min；加入10%硝酸铝溶液1.4 mL，混匀后静置6 min；加入1 mol/L的氢氧化钠溶液10 mL，用80%的乙醇定容至50 mL，摇匀，静置10 min，在波长510 nm处测定吸光值。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为y=11.346x-0.006 1（R2=0.999 4）。

玫瑰茄茶汤中总黄酮溶出量测定：取玫瑰茄茶汤5 mL于50 mL容量瓶中，按黄酮标曲绘制方法测定样品的吸光度，代入回归方程，得待测茶汤中总黄酮的含量。按下式计算样品茶汤内总黄酮的溶出量：

式中：C为提取液浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为提取液体积，mL；M为玫瑰茄质量，g。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 冲泡时间对花青素溶出量的影响

冲泡时间对花青素溶出量的影响见图1。

图1 冲泡时间对花青素溶出量的影响Fig.1 Effect of brewing time on the release of anthocyanidins

由图1可知，在一定冲泡时间内（20 min～40 min），玫瑰茄茶汤中花青素溶出量呈先增加后减小的趋势。当冲泡时间较短时，随着冲泡时间的延长，花青素溶出量增大；当冲泡时间为25 min时，花青素的溶出量最大，达6.82 mg/g；之后，茶汤中花青素的含量又逐渐减少。冲泡时间过短，玫瑰茄花未被充分浸泡，花青素还未大量溶出；但冲泡时间过长，花青素因受热易降解，且其他杂质组分的逐步溶出将导致茶汤中花青素含量降低[1，7]。

2.1.2 冲泡温度对花青素溶出量的影响

冲泡温度对花青素溶出量的影响见图2。

图2 冲泡温度对花青素溶出量的影响Fig.2 Effect of brewing temperature on the release of anthocyanidins

由图2可知，冲泡温度对玫瑰茄茶汤中花青素溶出有显著影响。随着冲泡温度升高，花青素溶出量呈先增加后降低的趋势；其中，在70℃时花青素的溶出量最大，为6.88 mg/g。温度较低时，分子的运动速度较慢，花青素溶出量较小；随着温度的升高，花青素的溶出速度增加，但当冲泡温度高于70℃时，花青素溶出量逐渐下降，因为花青素在温度较高的条件下，结构易被破坏，发生降解，温度越高，降解速度越快[20-21]。

2.1.3 茶水比对花青素溶出量的影响

茶水比对花青素溶出量的影响见图3。

由图 3 可知，当茶水比在 1∶20（g/mL）～1∶40（g/mL）时，花青素溶出量呈上升趋势，茶水比为1∶40（g/mL）时，溶出量达到最大值6.90 mg/g。原因可能为水的用量增多有利于花青素的溶出。但茶水比小于1∶40（g/mL）时花青素溶出量下降，原因可能为液体比例过大会稀释提取浓度，使花色苷含量降低[21]，且水量过大时，花色苷分子间作用力变小，其稳定性下降容易分解[7，22]。

图3 茶水比对花青素溶出量的影响Fig.3 Effect of tea-water ratio on the release of anthocyanidins

2.1.4 冲泡时间对总黄酮溶出量的影响

冲泡时间对总黄酮溶出量的影响见图4。

图4 冲泡时间对总黄酮溶出量的影响Fig.4 Effect of brewing time on the release of flavonoids

通过图4可知，在20 min～35 min范围内，冲泡时间过短，黄酮类化合物溶出不彻底，随着冲泡时间的延长，总黄酮溶出量逐渐增大；当冲泡至35 min时，总黄酮溶出量最大为57.28 mg/g；冲泡时间过长时，总黄酮溶出量减少，原因可能为黄酮类化合物在高温条件下易发生氧化[23]，也可能是玫瑰茄细胞内其他成分的溶出，干扰了黄酮类化合物的释放[24]。

2.1.5 冲泡温度对总黄酮溶出量的影响

冲泡温度对总黄酮溶出量的影响见图5。

图5 冲泡温度对总黄酮溶出量的影响Fig.5 Effect of brewing temperature on the release of flavonoids

通过图5可知，随着温度不断升高，玫瑰茄总黄酮溶出量增大，在70℃时总黄酮的溶出量达最大值57.22 mg/g。随着温度继续升高，总黄酮溶出量反而呈下降趋势。其原因可能是温度的升高促进了黄酮类物质的溶出，但水温过热影响其结构的稳定性，一些热敏性的黄酮类组分逐渐分解[25]；此外，水温过高时使其他非黄酮类杂质溶出，导致黄酮溶出量降低。

2.1.6 茶水比对总黄酮溶出量的影响

茶水比对总黄酮溶出量的影响见图6。

图6 茶水比对总黄酮溶出量的影响Fig.6 Effect of tea-water ratio on the release of flavonoids

通过图 6 可知，当茶水比在 1∶30（g/mL）～1∶50（g/mL）间时，玫瑰茄茶汤中总黄酮溶出量随茶水比的降低逐渐增大；当茶水比为1∶50（g/mL）时，总黄酮溶出量最大为 56.84 mg/g；当茶水比低于 1∶50（g/mL），总黄酮溶出量逐步降低。其原因可能为，当用水量较少时，玫瑰茄中的黄酮类化合物不能完全溶出；用水量太多，可能导致玫瑰茄中其他杂质的溶出，影响黄酮的溶出量[26]，且因水的稀释作用，造成茶汤中总黄酮含量的下降。

2.2 正交试验结果

玫瑰茄花青素的正交试验结果见表3。

表3 玫瑰茄花青素的正交试验结果Table 3 The results of orthogonal experiment regarding anthocyanidins from roselle calyces

由表3的数据结果可知，各因素对玫瑰茄茶汤中花青素溶出量影响的先后顺序为：C＞B＞A，即茶水比＞冲泡温度＞冲泡时间。确定的最优组合为A3B2C3，即冲泡时间30 min，冲泡温度70℃，茶水比1∶50（g/mL）。

因为正交表中没有上述最优条件的组合，为进一步考察试验的准确性，在该最优冲泡条件下，进行3次验证试验，测得玫瑰茄茶汤中花青素的溶出量为7.94mg/g，高于正交试验中的最高溶出量7.82 mg/g，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.81%，表明该冲泡条件重复性好，可为玫瑰茄花茶冲泡中花青素的有效释放提供理论依据。

玫瑰茄总黄酮的最佳冲泡工艺优化的正交试验设计及结果见表4。

表4 玫瑰茄总黄酮的最佳冲泡工艺优化的正交试验设计及结果Table 4 The results of orthogonal experiment regarding flavonoids from roselle calyces

由表4结果可知，各因素对玫瑰茄茶汤中总黄酮溶出量影响的先后顺序为：F＞G＞E，即冲泡温度＞茶水比＞冲泡时间。最优冲泡条件组合为E3F3G2，即冲泡时间40 min，冲泡温度80℃，茶水比1∶50（g/mL）。该最优组合恰好在正交试验表中，且所得总黄酮溶出率值最大为58.77 mg/g。

综合以上正交试验结果可以发现，玫瑰茄花茶中花青素和总黄酮冲泡的最佳条件参数不尽相同。在茶水比均为1∶50（g/mL）的条件下，花青素有效溶出的最适条件为70℃冲泡30 min，而总黄酮有效溶出的最适条件为80℃冲泡40 min。花青素是玫瑰茄中黄酮类化合物最重要的一大类，除此之外，还包含其他的黄酮类成分，如棉子皮亭、玫瑰茄红及其各自的配糖体、原儿茶酸、丁香酚，以及甾醇类的β-谷固醇、麦角固醇等。在冲泡玫瑰茄花茶时，除花青素外，其它具有水溶性的黄酮类化合物也会随同溶出。因此，在冲泡时，针对花青素和总黄酮有效溶出的冲泡条件不完全相同。

3 结论

本研究以玫瑰茄花茶茶汤中花青素及总黄酮的溶出量为指标，利用单因素试验确定冲泡时间、冲泡温度和茶水比对花青素及总黄酮溶出量的影响规律，在此基础上，进一步通过正交试验确定花青素及总黄酮有效溶出的最佳冲泡条件。为使花青素有效溶出，玫瑰茄花茶的最佳冲泡方式为：冲泡时间30 min，冲泡温度70℃，茶水比1∶50（g/mL），花青素溶出量可达7.94 mg/g。为使总黄酮有效溶出，玫瑰茄花茶的最佳冲泡方式为：冲泡时间40 min，冲泡温度80℃，茶水比1∶50（g/mL），总黄酮溶出量为 58.77 mg/g。本试验优化所得的花青素和总黄酮的最佳冲泡条件不尽相同，消费者可依据自身的喜好和需求选择合适的冲泡条件。