沉默高表达CDX2胃癌细胞中HNF4α表达水平的变化*

沈和德，杨文秀，褚明亮，易韦**，张著学

(1.贵州医科大学 基础医学院, 贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院 病理科, 贵州 贵阳 550004; 3.贵州医科大学附属人民医院 病理科, 贵州 贵阳 550002)

胃癌是来源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率在我国居于恶性肿瘤的首位[1-2]。肠上皮化生是胃癌重要的癌前病变之一，主要分为小肠型化生(Ⅰ型肠化生)和结肠型肠化生，后者又分为Ⅱ型和Ⅲ型肠化生[3]，而Ⅲ型肠化生发生胃癌的风险性较高[4-6]。在1975年，病理学家就提出胃癌的“瀑布”发展模式[7]，国内外的资料也显示胃癌发生与其他恶性肿瘤一样是多基因、多阶段变异累积的结果[8-9]。尾核同源盒转录因子2(caudal-related homeobox factor 2,CDX2)由311个单氨基酸组成，通过螺旋-环-螺旋结合于DNA的相应区域调节DNA的表达[10]。Mesquita等[11]的研究表明，CDX2在正常胃黏膜无表达，在多数胃黏膜肠化生呈阳性表达，说明CDX2异位表达是发生肠化生的重要调控因子。生理状态下，CDX2 只在肠道表达，CDX2胃黏膜上调表达可诱导肠上皮化生[12-13]，并认为该标志物在胃癌中起着重要的作用[14]。肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)是肝细胞核因子受体超家族中的一员,其编码基因位于人染色体20q13.12，包含12个外显子和11个内含子[15]。HNF4α是在多细胞动物中发现的核受体超家族的一种高度保守成员，在成人肝细胞中被称为组织特异性基因表达的主要调节因子[16-17]。HNF4α在胚胎的肝脏、肾脏、胰腺和胃肠组织中都有表达，在肠组织有较高表达[18-23]。查阅文献未见胃癌中CDX2与HNF4α相关研究报道，因此，本研究通过构建两者在胃癌细胞(AGS细胞)蛋白中表达，应用基因过表达、基因沉默及Western Blot 等方法研究两者间的关系。

1 材料与方法

1.1材料与试剂

AGS、BGC-823、 MGC-803、 MKN-45和 SGC-7901 这5种胃癌细胞购自中科院上海干细胞库，兔抗人CDX2单克隆抗体来自北京中杉金桥，二抗来自武汉三鹰生物技术有限公司，HNF4α单克隆抗体来自Abcam公司，二抗来自Santa公司，凝胶电泳仪、ClemidocTMTouch Imaging System、ClarityTMWestern Ecl substrate来自BIO-RAD公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒来自于碧云天生物技术公司，彩虹180广谱蛋白Marker来自Solarbio公司，In-Fusion HD Cloning Kits为Clontech公司产品，PrimeSTRAR HS 为TaKaRa公司产品，XbaI、BamHI均为BioLabs公司产品，细胞转染试剂jetPRIME购自 Polyplus公司，质粒抽提试剂盒和凝胶DNA快速回收试剂盒购于北京天根技术有限公司。

1.2方法

1.2.1胃癌细胞的培养 从液氮中分别取出冻存的AGS、BGC-823、MGC-803、MKN-45和SGC-7901这5种胃癌细胞，立即置于37 ℃的水浴锅中，使其迅速融化，然后将彻底融化的细胞转移至3 mL含血清和双抗的DMEM高糖的完全培养液中，将800 r/min离心 5 min，弃上清；用1 mL培养液将细胞重悬，将重悬后的细胞接种至25 cm2的培养瓶中，加入完全培养液，使其体积为5 mL，把细胞置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养，次日换液；密切观察细胞生长状态，每隔2～3 d换液。当细胞处于对数生长期、融合度达80%的时候，进行细胞传代，然后提取细胞蛋白。

1.2.2高表达CDX2、HNF4α胃癌细胞株的筛选 采用Western blot法，将提取的5种胃癌细胞蛋白，进行凝胶电泳转膜后、TBST液洗膜3次、每次各5 min，用封闭液封闭2 h后分别加入CDX2(1 ∶1 000)或HNF4α(1 ∶500)一抗，在4 ℃冰箱孵育过夜后TBST洗3次，分别加上相应二抗，孵育1 h，TBST液摇床上洗膜6次、每次各10 min，曝光显影、观察结果。以内参GAPDH(1 ∶20 000)作为内参照。

1.2.3CDX2基因沉默胃癌细胞株的构建 根据GenBank上CDX2的基因序列，利用Primer Premier 5软件设计，CDX2上游引物为5′-CCGGGGACAGAAGATGAGTGGAATTCTCGAGAATTCCACTCATCTTCTGTCCTTTTTG-3′，下游引物为5′-AATTCAAAAAGGACAGAAGATGAGTGGAATTCTCGAGAATTCCACTCATCTTCTGTCC-3′。上述序列用Blast search检测确定无同源性，此引物由上海生工技术有限公司合成。将合成后的引物插入慢病毒snRNA线性化载体上，其慢病毒载体连接和慢病毒转染方法参考文献[24]构建沉默CDX2 AGS胃癌细胞模型(模型组)，以转染空载AGS细胞作为对照。

1.2.4在沉默CDX2 AGS胃癌细胞中CDX2、HNF4α蛋白表达 以沉默CDX2 AGS胃癌细胞模型作为模型组，转染空载体AGS细胞作为对照组，分别收集培养2～3 d的2组胃癌细胞，提取总蛋白，CDX2、HNF4α蛋白表达水平检测方法同1.2.2项。

1.3统计学方法

2 结果

2.1CDX2与HNF4α蛋白高表达的胃癌细胞筛选

图1显示，HNF4α、CDX2在胃癌细胞株AGS中均有高表达。因此本研究选择胃癌细胞株AGS作为后续研究的胃癌细胞株。

注：(1)与AGS细胞比较，P<0.05。图1 高表达CDX2与HNF4α蛋白胃癌细胞筛选(Western blot)Fig.1 High expression CDX2 and HNF4α proteins in gastric cancer cells screening (Western blot)

2.2沉默CDX2胃癌细胞模型的构建

如图2所示，与对照组比较，CDX2基因沉默后AGS胃癌细胞中的CDX2蛋白明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，提示CDX2基因沉默AGS胃癌细胞株构建成功。

注：(1)与对照组比较，P<0.01。图2 两组胃癌细胞中CDX2与HNF4α蛋白表达(Western blot)Fig.2 Expression of CDX2 and HNF4α proteins in gastric cancer cells of two groups(Western blot)

2.3CDX2基因沉默的AGS细胞株中HNF4α蛋白表达

如图3所示，与对照组比较，CDX2基因沉默后AGS肠型胃癌细胞中HNF4α蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。

注：(1)与对照组比较，P<0.01。图3 沉默CDX2的AGS细胞中HNF4α蛋白表达(Western blot)Fig.3 Expression of HNF4α protein in AGS cells silencing CDX2(Western blot)

3 讨论

流行病学研究资料证实，胃黏膜肠化生的病人发生胃癌的风险明显增高，高达正常人的10倍[25]。Gonzalez等[26]对2 286例胃组织活检病理标本进行收集，运用前瞻性研究结合回顾性研究的研究方法，发现 91.6%的胃癌患者合并有Ⅲ型胃黏膜肠上皮化生；对胃黏膜伴有Ⅲ型肠上皮化生的患者进行随访可以提高早期胃癌的诊断率。You 等[27]收集了1989—1990年3 000多例经胃镜活检、病理诊断为胃癌癌前病变的住院病人的临床资料，并对这些病人进行随访，于1994年又对这些病人进行了内窥镜和组织病理学检查，Logistic回归分析结果显示，胃镜检查发现有轻度肠化生的病人其胃癌发生风险是正常人的 17.1 倍，对于重度肠化伴有萎缩的病人，这一风险高达 29.3 倍。这充分说明胃黏膜肠上皮化生的发生与胃癌高度相关。在近来的研究发现HNF4α在肠化生及肠型胃癌细胞核也存在阳性表达[21]。特别是在Saandi等[22]的研究发现HNF4α与CDX2在结直肠癌存在相关性。

所以本实验研究通过CDX2和HNF4α在5种胃癌细胞系中的表达发现，其两者均在AGS胃癌细胞都有较高的表达；筛选了AGS细胞蛋白作为基因沉默靶细胞，并且成功构建CDX2的沉默质粒在AGS胃癌细胞沉默表达，实验结果显示在CDX2基因沉默的AGS细胞蛋白中，HNF4α也呈低表达。

综上所述，在高表达AGS胃癌细胞中沉默CDX2后，HNF4α也出现低表达，说明CDX2和HNF4α蛋白在胃癌细胞中存在相关性表达，其具体机制有待进一步的研究。