核磁共振扩散序谱的研究及应用进展

张 鹏，陈 媛，罗 维*

(1.华南理工大学 分析测试中心，广东 广州 510641;2.工业和信息化部电子第五研究所 电子元器件可靠性物理及其应用技术重点实验室，广东 广州 510610)

液相扩散系数是研究分子传质过程、传质速率的重要基础数据。自扩散系数的大小与溶质分子的结构及其所处介质环境有关。通过测定自扩散系数，可以定性或定量表征液相分子的相关物理化学性质，例如分子尺寸、分子量、聚集状态及分子间相互作用等。核磁共振技术是化合物结构及成分测定的有效手段，在物理、化学、生物、医药、食品等领域得到了广泛应用。1950年，Hahn提出“自旋回波”的概念[1]，并阐明了在非均匀磁场中扩散效应对回波幅度的影响，奠定了核磁共振扩散研究的理论基础。随着核磁共振技术软硬件的发展，基于脉冲场梯度(Pulsed field gradient ,PFG)的核磁共振研究以其快速、无损、样品用量少、受杂质影响小等特点，成为测量液体及溶液样品自扩散系数的重要手段。

1991年，Johnson等率先开发了一种用于直观展现扩散系数的伪二维谱[2]，即扩散序谱(DOSY)。其中一维是化学位移，另一维是扩散系数(D或者logD)，可分别通过衰减信号的傅立叶变换和拉普拉斯变换产生，且不同分子的信号按照扩散系数大小依次排序。由于DOSY非常适合用于分析溶液中的小分子混合物与生物分子，因而很快为化学、生物等领域的科学家所接受。二维DOSY中最常用的是1H-DOSY，因为1H原子核具有较大的磁旋比，天然丰度高、信号强。但1H NMR谱宽较窄，在某些复杂混合物中信号重叠严重。为了提高化学位移维的分辨率，研究人员将DOSY实验拓展到其他原子核，例如：7Li、13C、19F、23Na、31P、119Sn、133Cs、195Pt等等[3-9]。与氢核相比，这些原子核的化学位移范围更宽，弛豫时间长、线宽窄、无自旋耦合(或很少自旋耦合)，能够显著提高DOSY谱图的分辨率。但其磁旋比较低，梯度效率损失过大。王英雄课题组[10]利用低温1H- 和19F-DOSY研究糖基化反应中的活性中间体，19F-DOSY大大降低了谱图的复杂程度，提供了更多关于反应路径的信息。

Gorenstein首先提出了三维DOSY(3D-DOSY)的概念[11]，并将DOSY与二维谱奥氏核效应效换相关谱(NOESY)联用，成功地解决了DNA双链体和二核苷酸谱峰重叠的问题。此后，3D-DOSY 发展迅速，几乎所有类型的二维谱都能与DOSY结合使用，例如：同核化学位移相关谱(COSY)[12-14]、全相关谱(TOCSY)[15-16]、异核单量子相关谱(HSQC)[16]、异核多量子相关谱(HMQC)[17]和J分辨谱(J-Res)[14,18]等。DOSY可以区分扩散系数差异为1%的化合物。但在信号重叠时，DOSY的效果不佳，此时需要借助分子间相互作用，扩大被分析物扩散系数的差别。通常的做法是向混合物中加入更多的共溶质或基质，以选择性地调节分子的扩散行为[19-21]，最终实现扩大各组分扩散系数差异的目的，这种方法被称为基质辅助DOSY。合适的基质是实验成功的关键，常见的基质[19]有硅纳米粒子类、聚合物类、表面活性剂类、微乳液类，等等。黄少华等[22]研究发现聚二甲基硅氧烷(PDMS)对大部分类型有机分析物都具有显著的分离能力，是一类理想的通用型基质。基质辅助DOSY可用于同分异构体的分析，包括分离位置异构体、对映异构体、差向异构体等。例如王英雄等[23]以Ga2+离子为基质，成功区分出D-葡萄糖的α-和β-端基异构体。

目前DOSY实验主要应用于以下4个方面：(1)用于复杂混合物的成分分析。依据不同分子扩散快慢，鉴定药物[24-26]、膳食补充剂[27-28]、食品[29-32]、饮料[33-38]以及生物提取物[39-43]中的各基质成分；(2)测量分子的大小[44-46]，例如纳米颗粒尺寸等；(3)测量分子量[47-53]，例如高分子聚合物中的分子量分布等；(4)研究化学、生物系统中溶液分子间的相互作用[54-55]，评估主体与客体分子之间的缔合常数[56-57]。

图1 脉冲场梯度自旋回波(PFGSE)序列[58]Fig.1 Pulsed field gradient spin echo(PFGSE) sequence[58]red,green and blue represent the gradient pulse intensity of 2%,50% and 95%,respectively(红、绿、蓝分别代表2%、50%、95%的梯度脉冲强度)

1 脉冲场梯度及脉冲序列的发展

1.1 脉冲场梯度

脉冲场梯度是DOSY实验的基础，可以在分子扩散运动与场梯度强度之间建立明确的数学关系。图1所示是1H-DOSY实验最基础的脉冲场梯度自旋回波(PFGSE)序列，由射频脉冲及场梯度脉冲组成。场梯度的主要作用是进行空间定位，包括相位编码及频率编码，可通过场梯度明确空间上的任意位置。而射频脉冲主要用于发射及采集信号，通过回波信号来了解样品的特性。

图2描述了PFGSE脉冲序列下，原子核磁化强度矢量的演化行为，图1和图2中不同强度的梯度脉冲通过颜色一一对应。第一个标准90°x射频脉冲将磁化强度矢量沿x-y平面的x方向对齐(黑色箭头)，各自旋相位相干。第一个梯度脉冲将磁化强度矢量沿x-y平面和z轴扭曲为螺旋形状，即编码。所谓“编码”指脉冲场梯度通过与空间呈线性关系的相位角，记录各自旋所处的位置。磁化强度矢量的螺旋程度取决于梯度脉冲的强度和脉宽。两个梯度脉冲之间的时间称为扩散时间Δ(紫色)，样品在该段时间内进行自扩散，不同组分按各自速率自由扩散。扩散时间Δ期间，施加一个180°x射频脉冲，有抵消磁场不均匀性的作用。演化时间之后，通过第二个梯度脉冲“解码”。因此，磁化强度矢量的相位变化是两次梯度脉冲以及180°x射频脉冲共同作用的结果。在没有扩散作用及横向弛豫的理想情况下，螺旋会被完美的退绕并返回同相自旋，从而可以探测到最大回波信号。在实际情况下，由于分子扩散等作用的影响，两个梯度脉冲引起的相位变化不会完全抵消。仅一部分的磁化强度矢量(较小的箭头/圆圈)被第二个解码脉冲恢复(颜色编码与第一个梯度脉冲的梯度强度匹配)。因此，扩散会导致信号强度降低，信号衰减取决于螺旋螺距Λ，即取决于梯度脉冲强度(g)和脉宽(δ)，公式表达为：

I=I0exp[-Dγ2g2δ2(Δ-δ/3)-R]

(1)

I为观察到的信号强度，I0为不加场梯度时的信号强度，D为扩散系数，γ为旋磁比，Δ为扩散时间，R为考虑弛豫的常数项，对于PFGSE脉冲序列而言，R=2τ/T2(τ为射频脉冲间隔时间，T2为横向驰豫时间)。如图2所示，梯度功率越高(绿色：50%，蓝色：95%)回波信号强度越小。改变梯度脉冲强度g，可采集到衰减程度不同的一组谱峰，经指数拟合便可求得扩散系数D。通过对化学位移轴上数据点对应的扩散系数进行拉普拉斯变换[59]，可得到二维DOSY谱，f1维代表扩散系数(D或者logD)，f2维代表化学位移。

图2 磁化强度在PFGSE脉冲序列下的演化过程图示[58]Fig.2 Evolution process of magnetization under the PFGSE pulse sequence[58]

图3 基于场梯度的脉冲序列[55]Fig.3 Pulse sequence based on field gradient[55]A.SE[60]；B.STE[61]；C.LED[2]；D.BPPLED[63]

1.2 DOSY脉冲序列研究进展

随着连续波核磁共振波谱发展为脉冲傅立叶变换波谱，核磁共振扩散研究在脉冲序列开发上取得了长足的进步，图3给出了几种常见脉冲序列的时序图。Tanner和Stejskal率先实现了基于脉冲场梯度的自旋回波实验[60]，采用的脉冲序列简称为PFGSE(Pulsed field gradient spin echo)。该脉冲序列遵从自旋-自旋弛豫，即横向弛豫T2。对于某些研究对象(例如黏度较大的高分子溶液等)，横向弛豫时间过短，远小于测量所需的分子扩散演化时间(通常为几百毫秒量级)，从而导致回波信号严重衰减、难以检测。为了解决这个问题，Tanner提出了基于脉冲场梯度的受激回波PFGSTE(Pulsed field gradient stimulated echo)[61]脉冲序列。在该脉冲序列作用下，磁化矢量大部分时间在z轴演化，横向弛豫T2的影响减小，纵向弛豫T1占据主导[62]。对于大多数T1≥T2的体系，该序列能减小弛豫时间对信号强度的影响，因此大大提高了实验灵敏度。

早期核磁共振谱仪的探头使用大量金属材料，但梯度脉冲的快速上升/下降会在探头内部产生“涡流”，导致谱图相位畸变、谱峰重叠。Gribbs等在PFGSTE序列的基础上，开发了纵向涡流延迟脉冲序列LED(Longitudinal eddy-current delay)，大大提高了DOSY实验的准确性和重复性[2]。Wu等[63]将双极梯度脉冲(BPP)与LED组合使用，成功地减小了95%的涡流。与LED实验相比，BPPLED脉冲序列将有效梯度输出增加了一倍，能用来测量相对较低的扩散系数。近年来商业化探头的屏蔽越来越成熟，梯度技术不断提高，涡流的影响已微乎其微，使用常规的自旋回波(SE)、受激回波(STE)脉冲场梯度序列即能得到很好的实验结果。另一方面，NMR脉冲设计的经验法则是，更多的脉冲等于更低的灵敏度[58]。如果实验不需要用到长脉冲序列的某些特殊优点，那么应尽量避免选择很长的脉冲序列，以提高信噪比、缩短实验时间。因此，LED和BPPLED序列的使用有所减少。

核磁管中的对流是影响实验结果的另一个重要因素，低黏度、低沸点的溶剂(例如：氯仿)易受温度梯度影响，产生对流，影响数据质量。Müller等[64]设计了两个串联的PFGSTE脉冲序列，可以有效地消除对流影响。布鲁克谱仪采用了这种设计，其标准脉冲程序库中的dstebpgp3s序列包含一个双STE片段，该片段具有3个扰流梯度[64]，非常适合处理核磁管中的对流，但灵敏度不高。刘买利等[65]提出了基于双PFGSE的双脉冲梯度场多自旋回波(DMSE)序列，可以有效地消除溶剂对流、背景场梯度、自旋-自旋耦合等因素的影响，准确测定小分子代谢物的扩散系数，适用于复杂生物样品。随着核磁共振技术的不断发展，越来越多的脉冲序列被开发出来，用于满足扩散实验现实应用的需要，例如：减小J耦合影响[66-67]、压制溶剂峰[68]、减少相位循环[69-70]、扩大扩散系数测量范围[71-72]等。研究人员可以根据样品特点及需要，选择合适的脉冲序列。

值得注意的是，实验参数的设置对测试结果有较大影响，主要影响因素[58]包括：脉冲序列类型、场梯度脉冲强度g、扩散延迟时间Δ、脉宽δ、梯度步长、扩散拟合程序等等。研究人员有必要深入了解研究对象与脉冲程序之间的匹配程度，针对不同类型的样品，选取合适的信号采集及处理程序。

2 应用领域及研究进展

2.1 扩散系数D

溶液中分子的扩散速度受分子大小、形状、分子量以及浓度、温度、溶剂等因素的影响。当外界条件固定时，不同种类的分子在相同环境中将表现出不同的扩散系数，基于此可以区分混合物中的各个组分，例如：药物、膳食补充剂、食品和其他复杂物质(植物提取物、动物/人类生物基质等)。2005年以来，已有多篇DOSY用于混合物鉴别的综述，内容非常详尽[56,73-75]，本文简单介绍其中几种典型的应用。

在药物领域，DOSY常用于鉴别假冒伪劣制品，例如抗生素[76]、抗抑郁药[77]、紧急避孕药[78]、抗疟药[79]等。DOSY可同时提供活性药物成分(API)和赋形剂的信息，给出药物制剂各组分的化学指纹。研究人员发现市场上伪造最多的是用于治疗性功能障碍的药物[80]，例如“西力士”和“伟哥”。将真品药物与仿制药进行比较，大多数制剂都含有效的API成分，正品与仿制品之间的区别在于含有不同的赋形剂。而某些紧急避孕片剂[78]、抗疟疾[79]药物中，含有错误的API甚至不含API，将会严重影响服用者的健康。在我国某农村地区出现了一种名为“止痛胶囊”的药品，未标明成分及含量，存在用药安全隐患。邓志威等[81]通过DOSY测试手段发现其中4种主要成分，结合其他谱图确定其API成分为对乙酰氨基酚、布洛芬。

中草药化学成分复杂，需经过繁琐的分离纯化过程以鉴别其中的活性成分。本课题组[82]对余甘子活性成分进行了提取分离，利用一维、二维NMR鉴定了18种化合物结构。唐亚林等[83-85]借鉴组学概念，将DOSY与生物靶分子的识别结合，进行天然抗肿瘤化合物的快速筛选和结构鉴定。在川黄柏皮、黄连根茎等提取物溶液中加入生物靶分子，活性小分子与大分子结合后扩散变缓，两者对应信号处于相同扩散带，由此明确了活性小分子的特征谱峰，进一步通过HSQC、异核多键相关谱(HMBC)实验鉴定了活性小分子的结构。陈忠等[86]应用DOSY原位分析丹参混合液，高效、准确地确定了其主要成分丹参素钠、丹参酮。陈福欣等[87]利用DOSY详细研究了黄芪和左金丸对α-糖苷酶的抑制作用。

在高分子领域，DOSY常被用于评估共聚物的聚合状态。若DOSY谱图中显示多组不同扩散系数的信号，表明共聚物中存在单体杂质或均聚物混合物。本中心核磁组为多个课题组提供了DOSY测试支撑[88-90]，以丙交酯(LA)、环氧乙烷(EO)、酞酐(PA)的三元共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA为例[88]，如图4A所示，聚丙交酯(PLA)、环氧乙烷与酞酐交替共聚物P(PA-alt-EO)的混合物表现出两组不同扩散系数的信号，D=1.86×10-10m2/s处归属为P(PA-alt-EO)，D=1.37×10-10m2/s处归属为PLA，与之相对应的是三元共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA在图4B上只呈现一组信号(D=1.41×10-10m2/s)。结合核磁氢谱、排阻色谱等实验手段，证明成功制备了该三元共聚物。

图4 PLA与P(PA-alt-EO)掺杂的混合物(A)及反应后的三嵌段共聚物PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA(B)的1H-DOSY谱图[88]Fig.4 1H-DOSY spectra[88]of a blend of P(PA-alt-EO) and PLA(A) and the PLA-b-P(PA-alt-EO)-b-PLA triblock terpolymer(B)

扩散系数的改变也能反映分子络合或组装程度的变化。在主客体识别的体系中，往往通过改变物质的浓度、观察扩散系数随浓度的变化来表征分子间相互作用、微观结构的变化。以微乳液为例[91-92]，O/W型微乳液中Doil≪Dwater(通常Doil为10-11m2/s量级，Dwater为10-9m2/s量级)，W/O型微乳液中Dwater≪Doil，在双连续型微乳液中Dwater和Doil都很高(约为10-9m2/s)，并且数值非常接近。如果水和油的相对D值相差一个以上数量级，则意味着缓慢扩散溶剂中含有离散颗粒；如果它们具有相同的数量级，则意味着存在双连续结构。

2.2 流体动力学半径RH

DOSY可用于测量纳米粒子[93]、表面活性剂胶束[94]、脂蛋白[33-34]、超分子聚集体[35-36]、低聚糖[95]等粒子的尺寸。粒子尺寸与扩散系数密切相关[44-46]，可以利用斯托克斯-爱因斯坦公式(2)来估算扩散粒子的流体动力学半径(也称为斯托克斯半径)RH：

RH=kT/(6πηD)

(2)

式中，k是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，η是介质的粘度。公式假设一个胶体尺寸的硬球形颗粒(直径远高于溶剂的球形颗粒)在连续流体中匀速移动。对于较大形状的分子，其分子各个轴向的差异并不大，因此，公式(2)可以用来估算RH的合理近似值。

以金纳米颗粒为例，纳米颗粒在材料、物理、电气工程和生物医学工程等领域具有广泛应用，其大小和纳米颗粒的表面化学性质是两个关键参数。通常，纳米粒子的大小由电子显微镜确定，表面化学性质利用光谱学来表征，例如红外和拉曼光谱。Yarger课题组[93]利用DOSY等核磁共振波谱对金纳米颗粒的尺寸、表面化学性质和结构进行了表征，为纳米颗粒的尺寸测定和表面化学研究建立了更先进、便捷的方法。值得注意的是：通过扩散系数定量的纳米颗粒尺寸，往往与透射电镜测量的尺寸有差异，且比电镜测量尺寸稍大。这是因为电镜主要专注于测量金属核的物理尺寸，而DOSY则考虑了与纳米颗粒表面结合的配体，测量对象是溶液中粒子的有效水合直径。

2.3 分子量Mw

DOSY可用于测定聚合物[58]、多糖[48]、蛋白质[96]等的分子量分布，依据所使用的标准物质，大致可分为内标法和外标法两种。外标法需选择合适的参考物质，通常是结构与待测物相似的已知化合物。首先测量出参考化合物扩散系数D与分子量Mw的双对数关系图。然后在相同的实验条件下，测量未知化合物的D值，将其带入标准曲线中，推导出未知化合物的分子量Mw。Li等[47]通过DOSY实验测定了各种活性/受控聚合过程生产的聚合物的平均Mw。采用外标法，利用已知窄分散聚苯乙烯的logD和logMw，在3种常用受控聚合方法中准确监控聚合过程，测试结果与凝胶渗透色谱法(GPC)数据高度吻合。Stalke等提出了一种新颖的DOSY测试分子量的方法[51-53]，基于具有归一化D的外部校准曲线(ECC)，进行分子量测定。研究人员提供了31种小分子模型，分子量Mw范围为70～600 g/mol，可根据待分析物的分子形状(紧凑球形、耗散球形、椭圆形、圆盘形)选择相应的标准曲线。

内标法是向待分析物样品中添加内部参比物，以获得内部校准曲线(ICC)[49]。该方法需要惰性的内部参考物质，参考物质应具有理想的分子量分布，并且信号与溶液中的其他组分不重叠。李红卫等[96]以3-(三甲基硅基)丙磺酸钠(DSS)为内标，通过蛋白质分子与DSS 自扩散系数的比值(Dr)来表征蛋白质分子在溶液中的表观分子量，有效地降低了仪器、样品浓度、缓冲体系的影响。

2.4 分子间缔合常数Ka

基于NMR的化学位移滴定法是确定缔合常数Ka的有力工具，被广泛用来量化多组分系统中分子间的相互作用[44]。在某些情况下，化学位移滴定法容易将酸碱化学反应与分子间的结合过程相混淆。相比之下，质子转移对DOSY的影响微不足道，因此DOSY可以作为化学位移滴定法的有效补充[56-57]，减小由此带来的误差。但DOSY测量缔合常数有局限性，通常只能确定10～105L/mol范围内的Ka。1>∶1配比的主客体复合物(HG)，其主客体之间的Ka可以通过公式(3)来计算。[H]、[G]、[HG]分别是体系平衡时主体、客体、主-客体复合物的浓度：

Ka=[HG]/[H][G]

(3)

Guella等通过DOSY研究了香兰素的自聚集以及与β-环糊精的络合平衡[37]。香兰素在水中的自缔合常数很低(Ksa=(9.8±0.7 )L/mol)，表明其以游离和少量低聚物的形式存在。对于β-环糊精水溶液，DOSY没有检测到任何聚集现象。改变香兰素/β-环糊精混合物的浓度(2～15 mmol/L)，得到的香兰素/β-环糊精络合常数(Ka)比香兰素自聚集Ksa高一个数量级，从(86±7 )L/mol增加到(142±9 )L/mol，且呈现非单调变化趋势，表明Ka实际上是一个“表观”平衡常数。证明除了(1>∶1)香兰素/β-环糊精络合物之外，还存在其他缔合络合物，例如(香兰素)2和(香兰素/β-环糊精)2。

3 结论与展望

DOSY可以通过测量混合物的扩散系数，分离鉴别混合物组成，提供分子尺寸、分子量、分子间相互作用及聚集状态的具体信息，已成为研究化学和生物系统中分子扩散的首选方法。随着混合物体系复杂程度的增加，DOSY的分辨能力及灵敏度是制约未来扩大其应用范围的关键所在。仪器和软件的快速发展，例如超高磁场磁体(1.2 GHz)、高灵敏度超低温探头、快速2D脉冲序列的出现，将使DOSY实验更加准确和高效。除此之外，波谱学家们也在尝试通过增加谱图维度、优化分离算法、添加基质调控扩散系数等手段[38]，不断扩大DOSY的应用范围。综上所述，DOSY实验未来会越来越成熟，可为研究者提供可靠、高效的混合物表征手段。