16 111例广西不孕不育患者的地中海贫血筛查及基因检测分析▲

陈一君 唐兰艳 韦雅淑 韦丽丽 谢丹尼

(广西壮族自治区生殖医院检验科，南宁市 530021，电子邮箱：lanceiot@163.com)

地中海贫血是一种由基因缺陷引起的常染色体隐性遗传性疾病，一般分为α型、β型、δβ型和δ型4种类型，其中α型和β型地中海贫血更为常见。重度α地中海贫血又称Hb Bart′s胎儿水肿综合征，患儿多为宫内死亡或出生后不久死亡；而重度β地中海贫血婴儿需长期输血维持，常因铁负荷大而导致一系列并发症[1]，两者均给社会和家庭带来沉重负担。体外受精-胚胎移植是实现不孕患者生育愿望的有效途径[2]，植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis，PGD)技术于1990年首次成功应用于临床后，PGD在连锁遗传病、单基因遗传病及染色体异常的诊断中得到越来越广泛地应用[3]。国内外已对地中海贫血携带者开展了PGD检测，获得了无相应致病基因胎儿的成功病例[4-5]。本文对16 111例来自广西各市县的不孕不育患者进行地中海贫血筛查后进一步进行基因诊断，从而分析其地中海贫血检出情况及基因分布情况，为遗传咨询、PGD和产前诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2018年1月至2019年12月期间来我院生殖医学科就诊并进行地中海贫血筛查和基因诊断的16 111例不孕不育患者。纳入标准：在我院行地中海贫血筛查和基因诊断；因主诉不孕进行体检的女性，或进入辅助生殖治疗周期的夫妇双方。排除在其他机构行地中海贫血检查者。其中男性5 930例、女性10 181例，年龄21～60岁，均来自广西各市县(见表1)。

表1 患者来源地区分布

1.2 方法

1.2.1 研究策略：所有患者均行血常规及血红蛋白毛细管电泳检测。其中平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)<82 fL和(或)平均红细胞血红蛋白量(mean corpuscular hemoglobin,MCH)<27 pg，血红蛋白(hemoglobin,Hb)A2<2.5%，检出血红蛋白异常带(如HbCS、HbH、Hb Bart等)均为筛查阳性，筛查阳性的患者进行α地中海贫血基因诊断；对HbA2>3.5%和(或)HbF>2%的患者进行β地中海贫血基因诊断。

1.2.2 血液学分析：抽取患者外周静脉血2 mL，置入含乙二胺四乙酸二钾的采血管内，充分混匀后，应用日本希森美康公司的全自动血液分析仪Sysmex-XS-800i检测Hb、MCV、MCH等。

1.2.3 血红蛋白毛细管电泳：抽取患者外周静脉血2 mL，放入含乙二胺四乙酸二钾的采血管内，充分混匀后，应用法国Sebia公司Capillarys 2全自动毛细管电泳分析仪检测HbA、HbA2、HbF及异常血红蛋白。

1.2.4 基因分析：(1)抽取患者外周静脉血2 mL，放入含乙二胺四乙酸二钾的采血管内，充分混匀，用亚能生物科技(深圳)有限公司提供的核酸提取试剂盒(批号：WB201706001-WB201909001)提取基因组DNA，并按试剂盒操作规程进行基因分析。(2)检测缺失型α地中海贫血基因(--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI)。使用深圳亿立方生物技术有限公司的缺失型α-地中海贫血检测试剂盒(批号：A1710005-A1911005)，应用GAP-PCR结合琼脂糖凝胶电泳技术进行检测。取样本DNA 4 μL，反应总体系25 μL，用T960型PCR仪(杭州晶格科学仪器有限公司)进行PCR反应，步骤为50℃ 5 min→96℃ 5 min→(98℃ 45 s→64℃ 90 s→72℃ 180 s)×35个循环→72℃ 10 min，取5 μL扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳(电压5 V/cm，60 min)，使用GelDoc XR凝胶成效系统(Bio-Rad公司)进行分析，记录结果。(2)检测非缺失型α地中海贫血基因(αQSα、αCSα、αWSα)。使用亚能生物科技(深圳)有限公司提供的非缺失型α-地中海贫血基因突变检测试剂盒(批号：AD201709005-AD201909005)，应用PCR-反向点杂交技术进行检测。取样本DNA 2 μL，反应总体系25 μL，用PCR仪进行PCR反应，步骤为50℃ 15 min→95℃ 10 min→(94℃ 60 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s)×35个循环→72℃ 5 min，取25 μL扩增产物进行杂交-洗膜-显色等操作，根据膜条蓝色斑点显现位置读取相应位置标注的基因型信息并记录结果。(3)检测β珠蛋白基因17个点突变。使用亚能生物科技(深圳)有限公司提供的β地中海贫血基因检测试剂盒(批号：BX201707006-BX201909006)，应用PCR-反向点杂交技术进行检测。取样本DNA 2 μL，反应总体系25 μL，用PCR仪进行PCR反应，步骤为50℃ 15 min→95℃ 10 min→(94℃ 60 s→55℃ 30 s→72℃ 30 s)×35个循环→72℃ 5 min，取出所有对应的扩增产物进行杂交-洗膜-显色等操作，根据膜条蓝色斑点显现位置读取相应位置标注的基因型信息并记录结果。

1.3 统计学分析 使用 Excel软件进行数据处理，描述性分析地贫基因类型及分布。

2 结 果

在16 111例患者中，共检出地中海贫血3 282例，总检出率为20.37%。其中，共检出α地中海贫血2 322例(检出率为14.41%)， 包括22种基因型，其中检出率最高为--SEA/αα(6.35%)，其次为- α3.7/αα(3.13%)、αCSα/αα(1.61%)和-α4.2/αα(1.31%)，见表2；共检出β地中海贫血960例(检出率为5.96%)，包括10种基因型，检出率较高的基因型为βCD41/42/βN(2.53%)、βCD17/βN(1.69%)和β-28/βN(0.55%)，见表3；共检出αβ复合型地贫144例(检出率为0.89%)，包含26种基因型，其中以--SEA/αα复合βCD41-42/βN(19.44%)、--SEA/αα复合βCD17/βN(18.06%)及-α3.7/αα复合βCDs41-42/βN(14.58%)最为常见，见表4。

表2 α地中海贫血的检出类型

表3 β地中海贫血的检出类型

表4 αβ复合型地中海贫血的基因型分布情况

3 讨 论

地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，是以珠蛋白链合成的减少或者缺如为特征，是严重威胁人类健康和生命的遗传性血红蛋白病。重型α地中海贫血在胎儿期可出现胎儿水肿等表现，造成死胎、死产；β珠蛋白基因在胎儿期基本不表达，其异常引起的重度β地中海贫血在患儿出生后会逐渐出现严重贫血等临床症状，进行性贫血将在3～6个月内逐渐出现，需要长期输血、除铁治疗或造血干细胞移植，均给个人、家庭和社会造成沉重负担[6]。血液学资料分析是筛查地中海贫血的可靠指标，MCV、MCH和血红蛋白电泳可作为地中海贫血不同基因型临床鉴别诊断的参考[7]。随着基因检测技术的不断发展，检测的成本相对降低，检测设备也相对普及，基因分型的覆盖面也越来越广，基因检测已成为地中海贫血诊断的金标准；血红蛋白电泳，特别是高效、蛋白区带分化清晰的毛细管电泳，也成为异常血红蛋白检测的必要手段[8]。鉴于广西地区地中海贫血发生率居高不下的现状，有学者提议此两项检查应在广西不孕不育人群就诊中作为常规检测项目，有条件的机构还可对异常病例进行高通量测序[9]，可进一步减少地贫及相关突变基因的漏检率。

既往调查显示，广西α地中海贫血、β地中海贫血基因的人群携带率分别为 14.95%、6.78%[10]； 刘富华等[11]对2012～2014年就诊的13 589例广西居民进行检测后发现，地中海贫血总检出率为21.09%，其中α地中海贫血、β地中海贫血的检出率分别为12.93%、8.16%。在本研究纳入的16 111例不孕不育患者中，地中海贫血总检出率为20.37%，其中α地中海贫血检出率为14.41%，β地中海贫血检出率为5.96%，αβ复合型地中海贫血基因检出率为0.89% ，与上述针对广西人群的研究结果相似，提示来自本地区的不孕不育人群与非特定人群的地中海贫血检出率大致符合，但是否表明地中海贫血携带与不孕不育的发生无相关关系，还有待进一步研究。

在针对各地区不孕不育患者的研究中，潘子湘等[12]在来自桂林地区的不孕不育人群中检出α地中海贫血和β地中海贫血基因总携带率为14.24%，其中α地中海贫血、β地中海贫血、αβ复合型地中海贫血的检出率分别为10.32%、3.42%、0.50%；王丽娟等[13]对来自深圳市的不孕不育患者进行检测，结果显示α地中海贫血和β地中海贫血基因总携带率为9.01%，α地中海贫血、β地中海贫血、αβ复合型地中海贫血分别为6.58%、2.69%、0.27%；姜柯安等[14]对来自四川省及周边地区不孕不育的患者调查中，检出α地中海贫血、β地中海贫血基因的携带率分别为2.03%、1.16%，总检出率为3.26%。本研究纳入了来自广西各市县的不孕不育患者进行分析，其地中海贫血检出率高于上述不同省份地区人群的检出率，也相对高于同在广西的桂林地区不孕不育人群，说明不孕不育人群中地中海贫血基因携带率有明显地域性差异。

本研究共检测出地贫基因型48种，其中常见的α地贫基因型为--SEA/αα，其次为-α3.7/αα、αCSα/αα和-α4.2/αα，常见的β地贫基因型为βCD41/42/βN、βCD17/βN和β-28/βN，各基因型构成比与王文杰等[15]针对广西人群的统计结果相似。而莫亚虹等[16]对来自海南地区的育龄夫妇的检测结果显示，最常见的α地贫基因型为-α3.7/αα，其次为-α4.2/αα及--SEA/αα；蓝惠华等[17]检出安徽及周边地区人群最常见的3种β地中海贫血基因类型依次为IVS-Ⅱ-654、CD41-42、CD17；姚莉琴等[18]在云南婚检人群中发现，主要的β地中海贫血基因型为βE、βCD17、βCD41-42。来自各不同地区的人群地中海贫血检出率、构成比或基因型分布有着较大差异，说明地中海贫血基因分布有明显地域差异与种族特征。

泰国缺失型地中海贫血(--THAI)于20世纪80年代首次被发现[19]，在泰国等东南亚国家多发，我国广东汕头、广西、香港、台湾等地亦有病例报道。其缺失约34Kb的α珠蛋白基因簇，累及α珠蛋白基因及ζ珠蛋白基因，--THAI突变纯合子由于不能合成胚胎期血红蛋白，故在妊娠早期不能存活[20]。在本研究中，共检出--THAI/αα携带者14例，占0.09%，略低于黎永鉴等[21]报告的梧州地区检出率(0.28%)；此外检出--THAI/αα复合βCD41/42/βN 2例，复合βCD26/βN 1例。国内大多数α地中海贫血基因诊断试剂盒主要针对3种常见的缺失类型(- -SEA、-α3.7、-α4.2)及突变类型(αQSα、αCSα、αWSα)，而泰国缺失型(--THAI)在广西人群中有一定发生率，且其中重症患者临床症状严重[22]，因此应加入常规α地贫基因检测类型中。

对地中海贫血高危夫妇进行产前诊断和选择性终止妊娠，是目前对于重症地中海贫血的有效预防措施。但相比于承受产前诊断与流产手术的风险，在以试管婴儿技术尝试妊娠的地贫基因携带者夫妇中进行PGD可能是更好的选择。第三代体外婴儿也称为PGD，对于一些已知遗传病的夫妇，在体外受精技术的基础上，从卵子、胚胎或囊胚中提取一些物质进行遗传检测，选择没有相应致病基因的胚胎进行移植[23]。对于同一类型的地中海贫血患者，在体外受精过程中采用PGD技术选择正常胚胎移植，可极大程度上避免中重度地中海贫血患儿的出生。在PGD的过程中，同时进行地贫与人类白细胞抗原的配型试验，选择与同胞儿童相同配型的非重度地贫胚胎移植，既避免了相应的地贫出生缺陷，可使用脐血和骨髓干细胞移植，治疗重症地中海贫血患儿[24]。

本研究的不孕不育人群地中海贫血检出率与本地区非特定人群相似，常见的α地贫基因型为--SEA/αα，其次为-α3.7/αα、αCSα/αα和-α4.2/αα，常见的β地贫基因型为βCD41/42/βN、βCD17/βN和β-28/βN，但不孕不育人群地中海贫血检出率和基因型分布或存在地域差异与种族特征。本研究的结果或可为进一步开展第三代试管婴儿技术提供分子基础和依据。本研究的样本量虽然较大，患者来源地区分布广西14个地级市，但多集中于南宁市和百色市，未能进行随机抽样纳入研究对象，人群的代表性可能不足。总之，开展基因诊断和血红蛋白检测，对地贫高危夫妇进行遗传指导，必要时进行PGD检测，将有效避免重症地贫儿的出生，降低出生缺陷，提高人口质量。