痰热清注射液血管刺激、溶血及过敏试验研究

张小利，贺 蓓，路发凯

（1.上海凯宝药业股份有限公司，上海201401；2.上海中医药大学实验动物中心，上海201203）

0 引言

痰热清注射液是一种由中药“有效部位群”研制而成的新制剂，方中以黄芩为君药，熊胆粉、山羊角为臣药，金银花为佐药，连翘为使药［1］。该药于2003 年5月通过国家药品监督管理局批准上市，临床上多用于治疗呼吸系统疾病［2］。目前痰热清注射液亦用于治疗新型冠状病毒性肺炎（COVID-19），同时中国临床试验注册中心批准了《大剂量痰热清注射液治疗新型冠状病毒性肺炎（COVID-19）真实世界临床研究》（注册号ChiCTR2000029432）和《痰热清胶囊治疗新型冠状病毒性肺炎（COVID-19）临床试验》（注册号ChiCTR2000029813）两项临床试验，以评价痰热清注射液治疗COVID-19的有效性及安全性［3］。本研究按照国家食品药品监督管理总局的《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》要求进行了血管刺激性、溶血及全身主动过敏反应（ASA）试验，为临床应用提供安全性再评价实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰白色家兔16 只，雌雄各半，体质量2.2～2.5 kg，购于上海市松江区车墩实验动物良种场，实验动物合格证号：SCXK（沪）2007—0008。新西兰白色家兔均饲养于上海中医药大学普通级兔房［SYXK（沪）2009—0069］，环境温度19～22 ℃，相对湿度60%～69%，换气次数≥8 次/h。人工控制照明，昼夜交替时间为12 h/12 h。清洁级哈特兰豚鼠28 只，雌雄各半，体质量207.9～264.1 g，购于上海生物制品研究所，实验动物合格证号：SCXK（沪）2009—0020。豚鼠饲养于上海中医药大学清洁级豚鼠房［SYXK（沪）2009—0069］，环境温度21～22 ℃，相对湿度46%～64%，换气次数≥15 次/h。人工控制照明，昼夜交替时间为12 h/12 h。所有动物实验严格遵守上海中医药大学实验动物伦理委员会的要求。

1.2 药品与主要试剂

痰热清注射液，上海凯宝药业股份有限公司生产（棕红色澄明液体，规格：10 mL/支，含量：0.335 g/mL（生药量/药液），批号：1308317），临用时用氯化钠注射液稀释成所需浓度的溶液；氯化钠注射液，上海长征富民金山制药有限公司生产（批号：121012 05C）；乌来糖，国药集团化学试剂有限公司产品（批号：T20110214）。牛血清白蛋白，上海源叶生物科技有限公司提供（白色结晶或类白色冷冻干燥粉末，批号：LJ0718SA13）。上述药品均密封，避光，置阴凉干燥处保存。

1.3 实验仪器

TC6K 型电子天平；Leica TP1020 全能型脱水机；Tissue-Tek VIP-5 全封闭组织脱水机；Histo Star 石蜡包埋机；HMS 70全自动染色机；HM340E型轮转式组织切片机；OLYMPUS BH-2光学显微镜、BX51型系统显微镜；DK-8A型恒温水槽；Agilent 8453型紫外分光光度计。

2 方法

2.1 血管刺激性实验

实验开始前，家兔经7 d 检疫，2 d 适应性饲养。家兔按体质量分层随机进行分3 组，每组4 只，雌雄各半，即痰热清注射液低剂量（1∶20稀释，浓度4.76%，给药容量3.51 mL/kg，相当于0.167 mL/kg痰热清注射液原液）、中剂量（1∶10 稀释，浓度9.09%，给药容量3.66 mL/kg，相当于0.333 mL/kg 痰热清注射液原液）及高剂量（1∶5稀释，浓度16.67，给药容量4.00 mL/kg，相当于0.667 mL/kg 痰热清注射液原液）。采用自身对照，每组4 只，雌雄各半。右侧耳缘静脉以无菌操作方法分别注射低、中及高剂量的痰热清注射液，左侧耳缘静脉注射等体积氯化钠注射液，每天1次（qd），连续给药3 d。于末次给药后72 h，肉眼观察注射部位有无红肿、充血等血管刺激症状，腹腔注射25%乌来糖麻醉处死动物，以耳缘静脉注射点至向心方向，每隔1.5 cm 取一段，每段1 cm，连续取3 段耳缘静脉连同周围组织，10%中性福尔马林溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切4 μm 薄片，HE 染色，光镜下进行组织病理学检查，另一侧对照血管也同法处理。

2.2 溶血试验

2.2.1 红细胞混悬液制备

实验开始前，家兔经7 d 检疫，2 d 适应性饲养。家兔心脏取血约10 mL，置洗净干燥的玻璃杯中，玻璃棒轻轻搅拌除去纤维蛋白，然后将去纤维蛋白血移入刻度离心管内加入10 倍生理盐水，摇匀后离心15 min（1 000 pr/min），倾去上清液，再加入约10 倍生理盐水混合离心，反复洗3次，至上清液呈无色透明，然后将所得红细胞按其容积，用生理盐水稀释成2%的红细胞混悬液80 mL备用。

2.2.2 加样观察

取洁净试管7支进行编号，1～5号管为痰热清注射液（1∶10稀释，浓度9.09%，给药容量3.66 mL/kg，相当于0.333 mL/kg 痰热清注射液原液），6 号管为阴性对照管（氯化钠注射液），7 号管为阳性对照管（灭菌纯水），按表1 所示依次加样，轻轻混匀后，立即置37 ℃±0.5 ℃的恒温水浴箱中进行温育，每隔15 min观察1次，1 h后，每隔1 h观察1次，观察3 h。同法重复3次。

2.2.3 结果判断

①全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。②部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。③无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。④凝聚：虽不溶血，但出现红细胞凝聚，振摇后不能分散。

2.3 全身过敏试验

2.3.1 致敏

实验开始前，豚鼠经5 d 检疫，1 d 适应性饲养。豚鼠按体质量分层随机进行分4组，每组6 只，♀♂各半，即阴性对照（氯化钠注射液，给药容量4.00 mL/kg）组、痰热清注射液低剂量（1∶10 稀释，浓度9.09%，给药容量3.66 mL/kg，相当于0.333 mL/kg痰热清注射液原液）组、高剂量（1∶5 稀释，浓度16.67%，给药容量4.00 mL/kg，相当于0.667 mL/kg痰热清注射液原液）组和阳性对照（2.5%牛血清白蛋白，给药容量1.00 mL/只）组。腹腔注射给药致敏，隔天给药1 次，共3 次。

表1 溶血性试验加样

2.3.2 激发

末次致敏后第14 天，阴性对照组、低剂量组、高剂量组、阳性对照组分别于豚鼠足跖静脉注射氯化钠注射液4.00 mL/kg，18.18%（1∶4.5稀释）痰热清注射液3.66 mL/kg，33.33%（1∶2稀释）痰热清注射液4.00 mL/kg，5%牛血清白蛋白1 mL/只，进行冲击。并按表2和表3观察动物注射后30 min内有无抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、休克甚至死亡等过敏反应症状，判断过敏反应程度。

3 结果

3.1 血管刺激性实验

12 只家兔耳缘静脉注射部位均未见红肿、充血等刺激现象。光镜病理组织学检查显示，各剂量痰热清注射液和对照组家兔耳缘静脉注射部位血管结构完整，血管内皮细胞无肿胀、变性、坏死,，管壁无炎细胞浸润，管腔内无血栓形成。

3.2 溶血试验

37 ℃±0.5 ℃恒温放置3 h 后，7 号管出现澄明红色，1～6 号管红细胞呈混悬状，未见溶血及凝聚现象发生。1 000 rpm，离心5 min 后，7 号管仍澄明红色，其他管内上清液无色澄明，表明无溶血现象发生。

3.3 全身过敏试验

阳性对照组有2 只豚鼠在致敏期间出现耳轻度红肿，持续1 d消失。激发后阳性对照组出现躁动、颤抖、搔鼻、痉挛等症状出现，最后全部死亡，过敏反应呈极强阳性；痰热清注射液及阴性对照组豚鼠未发现过敏症状即过敏反应阴性。

4 讨论

本品的人临床常用量一般为20 mL，重症患者一次可用40 mL，按成年人体重60 kg/人计算，其临床剂量约为0.33 mL 或0.67 mL 原液/kg/d。故本试验高剂量设为0.667 mL原液/kg，相当于临床最高剂量；中剂量设为0.333 mL/kg，约为高剂量的1/2，相当于临床常用量；低剂量设为0.167 mL/kg，约为中剂量的1/2。本实验采用的方法简便、准确、可靠，各项指标检测痰热清注射液均未出现阳性结果，说明该浓度的痰热清注射液对血管无刺激性，无溶血作用，全身主动过敏反应呈阴性。

表2 过敏反应症状

表3 全身过敏反应评价标准