CXCR4、VEGF在原发性睾丸淋巴瘤中的表达及临床意义

苏立乾 孟宏学

原发性睾丸淋巴瘤(PTL)是一种易中枢神经系统浸润、肿瘤相关致死率高的肿瘤，预后较差[1]。目前临床上缺少早期预测PTL中枢神经系统浸润的指标，这也长期制约着原发性睾丸淋巴瘤的治疗进展与患者的预后[2]。以往的研究提示趋化因子受体CXCR4与血管内皮生长因子VEGF的表达水平可能与淋巴瘤的中枢神经系统浸润有关[3-4]，因此本研究运用了免疫组化方法对PTL患者的组织切片中两种蛋白表达水平进行了检测，并且探讨了CXCR4和VEGF与PTL患者预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

59例原发性睾丸淋巴瘤组织选自哈尔滨医科大学附属肿瘤医院2000年1月—2015年12月手术切除标本或穿刺病理标本，且均已签署知情同意书，病理类型经病理科医生确诊均为非霍奇金弥漫性大B细胞淋巴瘤。确诊前均未接受化疗、放疗或其它抗肿瘤治疗。患者均为男性，年龄32～85岁，中位年龄54岁；组织学分类中生发中心来源(GCB)10例，非生发中心来源(Non-GCB)49例；临床病理相关资料包括年龄、部位、病理类型、ECOG评分、血清乳酸脱氢酶(LDH)、β2微球蛋白、Ki67(结果来自本院病理报告)、淋巴结外累及情况、淋巴瘤国际预后指数(International prognostic index，IPI)评分、Ann Arbor分期、治疗方法、是否完全缓解(Complete rremission，CR)、复发转移时间、部位及生存情况。

1.2 研究方法及结果判定

1.2.1 研究仪器和试剂 光学显微镜及照相系统购自上海Olymous公司，TEC-2601型摊片机购自常州市郝思林医用仪器有限公司，切片机购自德国Microm公司，切片盒购自哈尔滨市博润生物技术公司，恒温干燥箱购自上海福玛实验设备有限公司。兔抗人单克隆CXCR4抗体[UMB2](Ab124824，dilution 1∶100，Cambridge，UK)、鼠抗人单克隆VEGF抗体[VG-1](Ab1316，dilution 1∶200，Cambridge，UK)购自Abcam公司，增强型二步法检测试剂盒、DAB显色剂、PBS磷酸盐缓冲、免疫组化S-P试剂盒、中性树胶等购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 研究方法和结果判定 免疫组织化学具体操作流程严格按照试剂盒说明进行，以已知阳性切片做阳性对照(试剂公司提供)，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。采用Olympus显微镜观察组织切片染色情况。CXCR4及VEGF蛋白主要定位于细胞质，胞质内出现黄色、棕黄色或者褐色颗粒的细胞记为阳性细胞。随机选择10个高倍镜视野，将染色强度评分与阳性细胞百分比评分相乘为综合评分：(1)根据阳性细胞染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕色为2分，棕褐色为3分；(2)根据阳性细胞百分比进行评分：<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；(3)将阳性细胞比例与染色强度相乘结果为：≥6分为阳性，<6分为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS统计软件22.0版本对数据进行统计分析。CXCR4、VEGF与临床病理因素的关系采用χ2检验分析；应用Kaplan-Meier方法对CXCR4、VEGF表达情况进行生存分析；应用Cox回归模型进行预后分析；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCR4和VEGF的表达水平

CXCR4及VEGF蛋白在原发性睾丸淋巴瘤患者组织细胞中均有表达，但主要出现在细胞质中。59例PTL患者中，有31例患者CXCR4蛋白表达阳性(52.5%)，21例患者VEGF蛋白表达阳性(35.6%)(图1)。

图1 CXCR4和VEGF阳性表达情况Figure 1 The high expression of CXCR4 and VEGF in PTL tumor tissuesNote：A.The expression of CXCR4 in PTL tumor tissues(200×)；B.The expression of CXCR4 in PTL tumor tissues(400×)and IHC score(9)；C.The expression of VEGF in PTL tumor tissues(200×)；D.The expression of VEGF in PTL tumor tissues(400×)and IHC score(12).

2.2 CXCR4和VEGF的表达与原发性睾丸淋巴瘤患者临床病理特征的关系

CXCR4蛋白的表达与Ann Arbor分期、IPI评分、血清LDH水平、Ki67密切相关。CXCR4蛋白随患者Ann Arbor分期的增加表达增强(P<0.001)；IPI评分高的患者CXCR4蛋白表达增加(P=0.004)；CXCR4蛋白在血清LDH水平高的患者中高表达(P=0.004)；CXCR4蛋白的表达与Ki67有关(P=0.006)；其与患者年龄、部位、组织学来源、β2微球蛋白、复发状态等因素无关(P>0.05)。

VEGF蛋白的表达与Ann Arbor分期、IPI评分、B症状、血清LDH水平、是否复发、CR状态密切相关。VEGF蛋白随患者Ann Arbor分期的增加表达增多(P=0.014)；IPI评分高的患者VEGF蛋白表达增加(P<0.001)；VEGF蛋白在有B症状的患者中高表达(P=0.008)；VEGF蛋白的表达在血清LDH水平高的患者中表达增高(P<0.001)；复发的患者VEGF表达较未复发的患者表达增高(P<0.001)；VEGF蛋白在获得CR的患者中较未获得CR的患者中表达弱(P<0.001)；除此之外VEGF蛋白的表达与患者的年龄、发病部位、ECOG评分、组织学来源、Ki67等因素无关(P>0.05)(表1)。

表1 原发性睾丸淋巴瘤的临床病理特征及与CXCR4、VEGF表达的关系

2.3 CXCR4和VEGF在原发性睾丸淋巴瘤中表达的关系

在本实验59例原发性睾丸淋巴瘤组织中，二者在原发性睾丸淋巴瘤中的表达存在相关性(φ=0.423，P=0.001)(表2)。

表2 原发性睾丸淋巴瘤中CXCR4与VEGF表达的关系

2.4 CXCR4和VEGF与原发性睾丸淋巴瘤预后的关系

通过Kaplan-Meier分析发现，CXCR4表达高的患者较表达低的患者PFS与OS更差，差异具有统计学意义(P=0.021，P=0.031)(图2)，VEGF表达高的患者PFS与OS均更差，差异具有统计学意义(P<0.001)(图3)，提示CXCR4和VEGF表达高的患者预后较差。

图2 CXCR4蛋白表达强度的PFS和OS生存曲线Figure 2 PFS and OS curve for the CXCR4 expression

图3 VEGF蛋白表达强度的PFS和OS生存曲线Figure 3 PFS and OS curve for the VEGF expression

通过Cox单因素分析，结果显示Ann Arbor分期、IPI评分、B症状、血清LDH水平、中枢神经系统(CNS)受累、CR状态、CXCR4及VEGF表达等因素与预后相关，阳性患者的PFS和OS更短(P<0.05)；Cox多因素分析结果提示CR状态、CXCR4及VEGF表达等因素是影响PTL患者预后的独立因素(P<0.05)(表3，表4)。

表3 影响原发性睾丸淋巴瘤PFS预后的单因素和多因素分析

表4 影响原发性睾丸淋巴瘤OS预后的单因素和多因素分析

2.5 CXCR4和VEGF表达与原发性睾丸淋巴瘤中枢神经系统浸润的关系

中枢神经系统是原发性睾丸淋巴瘤常见的受累部位，患者预后差。本研究分析了CXCR4与VEGF蛋白的表达与原发性睾丸淋巴瘤中枢神经系统受累的关系。59例患者中11例在随访期间出现了CNS受累，而受累的11例患者中，10例CXCR4均高表达，9例VEGF蛋白高表达。由此可见，CNS受累的患者CXCR4与VEGF蛋白两者均明显高表达，差异有统计学意义(P=0.005，P=0.001)(表5)。

表5 CXCR4与VEGF蛋白的表达与原发性睾丸淋巴瘤中枢神经系统受累的关系

3 讨论

我国原发性睾丸淋巴瘤发病率正在逐年增加，并逐渐有年轻化的趋势[5]。PTL具有明显的结外侵犯趋势，常常侵犯中枢神经系统及对侧睾丸等区域，不能尽早发现以及采取预防措施，患者错过最佳治疗时机，从而影响其治疗效果和预后[6]。因为病理诊断患者数量的增多，在临床上，对这一类少见的淋巴瘤类型也越发引起重视。目前尚无针对原发性睾丸淋巴瘤中枢神经系统浸润的预测靶点，因此寻求具有提示作用的生物标记分子，针对高危患者及早预防治疗，研发针对目标靶向的药物显得尤为重要。

PTL发病率较低，所以关于它的大多数可用的研究数据均来自小型回顾性或非随机化的研究。一项基于人群的回顾性研究表明，5年和10年PTL无病生存率分别为62%和50%。同样，在以往的国际结外淋巴瘤研究组(IELSG)的回顾性研究中，患者的5～10年的无进展生存率分别为48%和33%。对于PTL，CNS浸润是一种较为严重的并发症[7]。据报道，CNS受累可发生在2%至8%的患者中，且平均复发时间较短，一般5～12个月。同时，发生CNS浸润的患者，中位生存期一般为2至5个月[8]。因此，对于CNS受累高风险的患者早期诊断及干预显得非常重要。然而，目前并没有确切的分子生物标志物用于识别PTL患者CNS受累高危患者。

近年研究证实了CXCR4在血液系统肿瘤中，有促肿瘤生长作用[9]。除血液系统外，包括外周非霍奇金淋巴瘤(NHL)，CXCLl2与其受体CXCR4在多种实体肿瘤中表达，例如肺，脑和乳腺癌等[10]。之前也有临床模型表明，肿瘤的定向转移与CXCR4的活化及向CXCR12表达的靶器官迁移的调节有关[11]。对于非小细胞肺癌(NSCLC)，CXCL12趋化因子介导肺癌细胞向脑迁移的受体激活ERK，这又反过来激活了IKKa/B和NF Rb信号传导通路，导致了整合素的激活(ITGB1和ITGB3)[12]。

血管内皮生长因子结构高度特异性，能促进肿瘤细胞的生长和转移。同时，VEGF还可促进了特异性趋化因子CXCLl2的迁移[13]。近期有研究发现，在小细胞肺癌中的VEGF介导的信号通路，VEGFR1表达水平与脑转移有关，并且VEGFR1信号是由胎盘生长因子(PLGF)促进小细胞肺癌细胞跨内皮迁移而进行介导的[14]。

在本研究中我们取得了类似的结果，我们发现CXCR4和VEGF蛋白高表达与低表达相比，患者的PFS和OS更差，且差异显著。我们的研究报告提出，这两种蛋白高表达也与PTL其他危险因素有关，如高IPI分级、血清LDH水平升高，发生复发的晚期肿瘤等，这表明这两种蛋白与恶性肿瘤的发生发展及转移关系密切。特别需要指出的是，本研究发现CNS受累与CXCR4和VEGF的表达有关，他们可能是在未经治疗的PTL患者CNS受累的重要预测因素。

以往的研究中有关CNS浸润的患者在临床上表现的高危险因素，如血清LDH升高，结外累及，骨髓受累等，但这些因素缺乏特异性[15]。脑脊液细胞学/流式细胞术是一种很好的诊断方法，但是由于操作成本高，而不被大多数患者所接受，除此之外，这种筛选方法敏感性低，只有大约50%CNS受累可以提早被检测出[16]。除了上述诊断方法，CT影像学和MRI磁共振成像也是诊断的一个重要的方法，但是它们不能对CNS受累进行预测，只有在复发已经发生时才能检出[17]。本研究发现90.9%(10/11例)的CNS受累患者CXCR4蛋白高表达、81.8%的CNS受累患者VEGF蛋白高表达，提示其对CNS受累的预测具有极高的敏感性。由于样本量小，我中心数据较其他已报道的数据有差异，但有一定的指导意义。更重要的是，这两个蛋白的高表达可以在病理诊断的早期进行检测并且对CNS受累进行预测，对这部分高危患者进行早期的预防性治疗如鞘内化疗、全脑放疗或CXCR4和VEGF的分子靶向等治疗。一些研究者指出，抑制CXCR4和VEGF两种蛋白的活性作为潜在的治疗靶点可能会成为未来治疗PTL更好的治疗策略。

综上所述，我们的研究表明，趋化因子CXCR4对于中枢受侵具有很强的趋化作用，而血管内皮生长因子VEGF可增强肿瘤的侵袭性，为其在中枢受侵方面的机制研究提供了理论基础；CXCR4、VEGF蛋白高表达的患者具有较高的中枢神经系统浸润的风险，因此可作为预测指标，针对高表达的这部分患者提前做好预防措施，进而可改善患者的预后；并且这两种蛋白可作为两个潜在的治疗靶点，为原发性睾丸淋巴瘤的临床治疗提供更好的治疗选择。