黔产犁头草中总黄酮的含量测定

龚小见，赵 超，周 欣*

(1.贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2.贵州师范大学 贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州 贵阳 550001；3.贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001)

0 引言

犁头草为菫菜科植物戟叶堇菜(ViolabetonicidoliaW.W.Sm)长萼堇菜(ViolainconspicuaBlume Bi)、及心叶堇菜(ViolacordifoliaW.Beck)的新鲜或干燥全草，别名铧头草、犁铧尖、犁嘴草、箭头草、如意草、玉如意、耳钩草等，多年生草本植物。具有清热解毒，散瘀消肿。用于乳痈，喉痛，目赤肿痛，疮疡肿毒，刀伤出血[1]。犁头草为贵州省习用少数民族药材，收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003版。

根据文献报道，犁头草具有较好的体外抑菌[2]和四氯化碳致小鼠急性肝损伤的修复[3]等作用，对化脓性关节炎[4-5]和慢性骨髓炎[6]有一定的临床疗效。犁头草中的主要化学成分为黄酮类化合物[7-10]，黄酮类化合物具有很强的抗氧化作用，是中药材发挥药效的主要化合物类型之一。犁头草收载于《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)中，但在该标准中没有含量测定项，不能全面地控制犁头草药材的质量。本文采用紫外分光光度法[11-17]，建立了犁头草中总黄酮含量测定方法，该方法简便快速，回收率高，可为黔产犁头草的质量控制标准提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

犁头草药材主要采自贵州省内不同地区，表1为犁头草样品采集地和采集时间的信息。药材经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为犁头草(戟叶堇菜ViolabetonicidoliaW.W.Sm)。芦丁(上海伊卡生物技术有限公司)；甲醇、乙醇、三氯化铝均为分析纯，蒸馏水。

表1 犁头草样品信息表Tab.1 Tested material of Viola betonicidolia and their local variety

1.2 仪器

酶标仪(Max Plus 384)，美国Moleaular Devices；AL 204万分之一分析天平和XS 105十万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；电热恒温水浴锅(DK-98-II)，天津市泰斯特仪器有限公司；离心机(TDL-5A)，常州万合仪器制造有限公司；数控超声波清洗器(KQ-300DE)，昆山市超声仪器有限公司；摇摆式高速万能粉碎机(DFY-200)，温岭市林大机械。

2 实验部分

2.1 标准溶液的制备

精密称取芦丁对照品约5.00 mg于25 mL容量瓶中，加入80%乙醇溶解，定容至刻度即得对照品储备液，浓度为0.2 mg/mL。

2.2 样品溶液的制备

精密称取犁头草药材粉末0.100 0 g(精确到0.000 1 g)，加入20 mL 80%乙醇溶液，精密称定后水浴回流提取，回流时间为1.0 h，室温放冷后补重，将提取液离心(3 500 r/min，5 min)，取上清液，即得供试品溶液。

2.3 测定方法

实验采用三氯化铝显色法，移取1.0 mL样品溶液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 0.1 mol/L的AlCl3，摇匀放置5 min后，用80%的乙醇定容至10 mL，摇匀放置5 min，每组平行测定3次。以空白试剂为参比，测定其在270 nm波长处吸光度值(A)。

2.4 线性范围考查

精密量取0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液0.0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，以80%乙醇为空白对照，加入1.0 mL 0.1 mol/L的AlCl3，摇匀放置5 min后，用80%的乙醇定容至10 mL，270 nm处测定吸光度(A)。以芦丁对照品溶液的浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明芦丁在浓度0.005～0.04 mg/mL范围内呈良好线性关系，回归方程A=4.290 5C-0.000 4(R2=0.999 9)，结果如图1所示。

图1 芦丁对照品标准曲线图Fig.1 Standard curve of rutin reference

2.5 精密度考查

取芦丁对照品溶液，按“2.3项测定方法”进行处理，测定270 nm吸光度值A，连续测定6次，结果RSD值为0.92%(n=6)，说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取6份犁头草药材0.100 0 g，置于具塞锥形瓶中，按“2.2 样品溶液的制备”方法制备供试液，以“2.3项测定方法”进行测定。结果RSD值为0.86%(n=6)，说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

精密称取犁头草药材0.100 0 g，按“2.2 样品溶液的制备”方法制备供试液，以“2.3项测定方法”进行测定。分别后于0.0 h、0.25 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h进行吸光度测定，结果样品溶液吸光度的RSD为0.75%(n=6)，说明样品溶液显色后在2 h内测定稳定。

2.8 加样回收率试验

取9份已知总黄酮含量的同一批犁头草药材0.050 0 g，分别精密加入适量芦丁对照品溶液，按“2.3项测定方法”进行测定，以空白试剂为参比，于270 nm处测定吸光度(A)并计算回收率。结果如表2所示，平均加样回收率为97.60%，RSD值为0.03%(n=3)，说明该方法准确度良好。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Add recovery experiment

2.9 样品含量测定

精密称取各批次犁头草药材0.100 0 g，置具塞锥形瓶中，按“2.2 样品溶液的制备”方法制备供试液，以“2.3项测定方法”进行测定，在270 nm处测定吸光度值，计算含量。结果如表3所示，贵州省内不同产地犁头草药材总黄酮含量在2.10%～4.04%之间，说明黔产犁头草药材质量稳定均一。

表3 黔产犁头草药材总黄酮含量Tab.3 Total flavones of Viola betonicidolia from different producing areas

3 结果与讨论

3.1 提取方法的考察

精密称取犁头草药材0.100 0 g，置于具塞锥形瓶中，加入20 mL 80%乙醇，精密称重后，分别用超声提取(300 W，40 KHz)、回流提取和热浸法，提取时间均为30 min，室温放冷后补重，将提取液离心，移取上清液1.0 mL按“2.3项测定方法”测吸光度值。结果显示，回流提取法提取的总黄酮含量最高，故选用回流提取法。

图2 提取方法的考察Fig.2 Investigation of extraction methods

3.2 提取溶剂的考察

分别以水，甲醇，乙醇溶液为提取溶剂，回流提取30 min，按“2.3项测定方法”测吸光度值。结果显示，乙醇提取液的总黄酮含量最高，故选用乙醇为提取溶剂。

图3 提取溶剂的考察Fig.3 Investigation of extraction solvent

3.3 提取溶剂浓度的考察

分别以40%，60%，70%，80%，100%的乙醇为提取溶剂，回流提取30 min，按“2.3项测定方法”测定吸光度值。结果显示，乙醇浓度为70%时提取效果最好，故选用70%乙醇做提取溶剂。

图4 提取溶剂浓度的考察Fig.4 Investigation of extraction solvent concentration

3.4 溶剂用量的考察

精密称取犁头草药材4份，每份0.100 0 g，分别加入10 mL、20 mL、30 mL、40 mL 70%乙醇溶液，回流提取，按“2.3项测定方法”测定吸光度值。结果显示，溶剂用量为20 mL后，提取的总黄酮含量逐渐趋平，因此选择提取溶剂用量为20 mL。

图5 溶剂用量的考察Fig.5 Determination of solvent dosage

3.5 提取时间的考察

精密称取犁头草药材5份，每份0.100 0 g，加入20 mL 80%乙醇，分别回流提取0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，按“2.3项测定方法”，测定吸光度值。结果显示，1.5 h时提取效果最好，故选择提取时间为1.5 h。

图6 提取时间的考察Fig.6 Investigation of extraction time

3.6 犁头草总黄酮提取方法的正交实验优化

以总黄酮含量为考察指标，在单因素试验优化的基础上，选择乙醇浓度、溶剂用量和提取时间作为考察因素(见表4)，设计L9(33)正交表进行正交试验优化提取工艺，对提取条件进行优化。

表4 正交试验考察Tab.4 Orthogonal test

由正交试验结果(表5)与极差分析(表6)可知：黔产犁头草总黄酮提取方法中，各因素对黄酮得率的影响主次顺序为B(溶剂用量)>A(乙醇体积分数)>C(提取时间)；有直观分析得出最佳提取工艺条件为A3B2C1，即乙醇体积分数为80%，溶剂用量为20 mL，提取时间为1.0 h。

表5 黔产犁头草总黄酮提取方法L9 (33) 正交试验结果Tab.5 Rthogonal test results of L9(33) for extraction method of total flavone of Viola betonicidolia from Guizhou

表6 正交试验设计的方差分析Tab.6 Analysis of variance for orthogonal experimental design

4 结论

本实验建立了黔产犁头草中总黄酮的含量测定方法，该方法精密度和重复性好、回收率高，且稳定可靠，操作简单实用，可用于黔产犁头草药材总黄酮含量测定。应用该方法对采自贵州10个不同产地的犁头草药材进行了总黄酮含量测定。结果发现，10个不同产地的犁头草药材中总黄酮含量均在在2.10%～4.04%之间，说明黔产犁头草药材在总黄酮含量方面质量稳定均一。