黑皮鸡枞菌液体培养基配方筛选

刘运伟，郭兴

(黑龙江省林业科学院伊春分院，黑龙江 伊春 153000)

黑皮鸡枞菌(Oudemansiellaradicata)，又名长根金钱菌、露水鸡枞、长根小奥德蘑等[1]，属中偏高温型菇类，为担子菌亚门(Basidiomycotina)、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、小奥德蘑属(Oudemansiella)的腐生菌[2]。近几年，黑皮鸡枞逐渐被人们所熟知，通过人工大面积种植，使栽培生产者看到了黑皮鸡枞的生产方式简便，市场前景较好的优点。为了使黑皮鸡枞产业迈入标准化、规模化、工厂化水平，研究液体菌种生产势在必行。液体菌种是一种高效的菌种[3]，可以达到快速生长，提高生产效率。本文对黑皮鸡枞进行液体培养基配方的筛选，为实际生产提供理论的指导。

1 材料

1.1 供试菌株

试验所用菌种来源于江苏高邮市科学食用菌研究所。

1.2 培养基

斜面培养基：去皮马铃薯 200.0 g、葡萄糖 20.0 g、琼脂 20.0 g，纯水定容至 1000 mL。

液体培养基：葡萄糖 3.0 g/100 mL、蛋白胨 0.3 g/100 mL、硫酸镁 0.05 g/mL、磷酸二氢钾 0.1 g/100 mL。

1.3 试剂

试验所使用的主要化学试剂均为国产分析纯或食品级：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、尿素、硫酸铵、KH2PO4、MgSO4、CaCO3、FeSO4、ZnSO4、NaCl、浓HCl、NaOH、VC、VB1、VB2、VB6。玉米粉、黄豆粉、小米粉为玉米、黄豆、小米经烘干粉碎过100目。

1.4 仪器与设备

主要仪器设备有超净工作台(东莞雅宁净化科技有限公司)，电热鼓风干燥箱(广州市旭朗机械设备有限公司)，BSD-YF3200智能精密型摇床(上海博迅医疗生物仪器股份有限公司)，YXQ-30SII高压灭菌器(济南杰岛分析仪器有限公司)，AUW120D电子天平(日本岛津)。

2 方法

2.1 菌种活化与接种

制作斜面培养基，在无菌条件下，取黑皮鸡枞菌种置于空斜面培养基的中间部位，置于恒温培养箱中25 ℃培养7天。

在无菌条件下，取黑皮鸡枞菌种的10个菌块接入到盛有150 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，在摇床上以25 ℃、150 r/min的条件培养7天。

2.2 实验测定方法

菌丝体生物量的测定：取培养7天后的黑皮鸡枞液体培养基，将培养基和菌丝体一起倒入滤网上，并用纯水反复冲洗，再将菌丝体置于培养皿中，放入70 ℃烘箱中至恒重后，称重[4]。

2.3 液体发酵培养基的优化

2.3.1 碳源试验。在配置液体培养基时，使碳源分别为3.0 g/100 mL的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、小米粉进行碳源单因素试验。

2.3.2 氮源试验。在配置液体培养基时，使氮源分别为0.3 g/100 mL的蛋白胨、黄豆粉、酵母膏、尿素、硫酸铵进行氮源单因素试验。

2.3.3 无机盐及不同添加量试验。在配置液体培养基时，使KH2PO4的添加量分别为0.05 g/100 mL、0.1 g/100 mL、0.15 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.25 g/100 mL。

在配置液体培养基时，使MgSO4的添加量分别为0.01 g/100 mL、0.03 g/100 mL、0.05 g/100 mL、0.07 g/100 mL、0.09 g/100 mL。

另在液体培养基中额外添加FeSO4、CaCO3、NaCl、ZnSO4，并与空白液体培养基进行比较。

2.3.4 维生素试验。在液体培养基中分别添加0.001 % 的VC、VB1、VB2、VB6。

2.3.5 正交优化。在单因素试验结果上，以碳源、氮源、无机盐、维生素为影响因子，建立 L9(34)正交表。

表1 正交试验表

3 结果

3.1 碳源试验结果

由图1中可以看出，黑皮鸡枞菌丝体以玉米粉为碳源的吸收利用效果显著高于其他碳源，菌丝体生物量达到1.592 g/100 mL；可能是玉米粉中含玉米素等多种营养成分，能促进菌丝体生长。因此，玉米粉为最佳碳源。

图1 碳源筛选试验

3.2 氮源试验结果

由图2中可以看出，黑皮鸡枞菌丝体以蛋白胨为氮源的吸收利用效果好于其他4种氮源，菌丝体生物量为0.848 g/100 mL；另外黑皮鸡枞菌丝体对尿素、硫酸铵的利用效果也较好，而对尿素和硫酸铵几乎不能利用。因此，蛋白胨为最佳氮源。

图2 氮源筛选试验

3.3 无机盐及其添加量试验结果

由图3、图4中可以看出，黑皮鸡枞菌丝体的生物量随KH2PO4添加量的逐渐增加出现先增加后降低现象，在KH2PO4添加量为0.1 g/100 mL时，菌丝体生物量获得最多为0.621 g/100 mL。因此，KH2PO4的最佳添加量为0.1 g/100 mL。

图3 KH2PO4对菌丝生物量的影响

图4 MgSO4对菌丝生物量的影响

由图4可以看出，黑皮鸡枞的菌丝体生物量随MgSO4添加量的逐渐增加出现先增加后降低现象，在MgSO4添加量为0.03 g/100 mL时，菌丝体生物量达到最大多为0.710 g/100 mL。因此，MgSO4的最佳添加量为0.03 g/100 mL。

由图5可以看出，在各无机盐浓度均为0.3 g/100 mL时，只有添加了NaCl的黑皮鸡枞菌丝体生物量为0.645 g/100 mL高于空白对照，而添加了FeSO4、CaCO3、ZnSO4的菌丝体生物量低于空白对照。因此，NaCl为最佳无机盐。

图5 无机盐筛选试验

3.4 不同维生素对发酵的影响

由图6中可以看出，在各维生素浓度均为0.001%时，只有添加了VB1的黑皮鸡枞菌丝体生物量为0.806 g/100 mL高于空白对照，而添加了VC、VB2、VB6的黑皮鸡枞菌丝体生物量低于空白对照。因此，VB1为最佳维生素。

图6 维生素筛选试验

3.5 优化正交试验

选取碳源为玉米粉，氮源为蛋白胨，无机盐为NaCl，维生素为VB1作为影响因子，建立L9(34)正交表，KH2PO4和MgSO4添加量分别0.1 g/100 mL和0.03 g/100 mL。

由表3可以看出，对菌丝体生物量影响最大的是氮源，其次是碳源，再次是无机盐，最后是维生素，最佳组合是A2B3C1D2，即玉米粉3 g/100 mL、蛋白胨0.4 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、MgSO40.03 g/100 mL、NaCl 0.01 g/100 mL、VB10.002%。

表3 正交试验结果

4 结论

随着科技的进步，工厂化生产将成为食用菌产业发展的新方向，而体液菌种生产正是工厂化所必需的，本文对黑皮鸡枞液体培养基进行研究、筛选，意在为黑皮鸡枞的工厂化、规模化、标准化生产打下基础。本文得出，黑皮鸡枞液体最佳培养基配方为：玉米粉3 g/100 mL、蛋白胨0.4 g/100 mL、KH2PO40.1 g/100 mL、MgSO40.03 g/100 mL、NaCl 0.01 g/100 mL、VB10.002%。