1种适宜伊春地区生长的羊肚菌菌丝培养试验

范冬茹，郭兴，高智涛

(伊春林业科学院，黑龙江 伊春 153000)

羊肚菌(MorchelladentaL.)又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，按Ain-sworth分类系统隶属于子囊菌亚门(Aseomycotina)、盘菌纲(Diseomyeetes)、盘菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属(Morchella)[1]。具有极高的营养价值和药用价值，是一种大型的食用兼药用真菌。它不仅营养丰富、味道鲜美，现代研究发现，羊肚菌含抑制肿瘤的多糖，具有增强机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等作用[2]。我国从20世纪80年代开始，多家单位进行了羊肚菌的人工栽培研究，也有报道室外人工栽培成功，但均不能稳产甚至很难重复。直到2000年，外营养添加技术(营养袋)的发明对室外羊肚菌人工栽培产生了积极的推动作用，现在全国大部分省份都有栽培，栽培的主要种类为梯棱羊肚菌(MorchellaimportunaM.Kuo et al.)、六妹羊肚菌(MorchellasextelataM.Kuo)及少量七妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)[3]。

伊春市位于中国黑龙江省东北部小兴安岭腹地的汤旺河流域，属寒温带大陆性季风气候。笔者通过引种栽培实验，筛选出了适宜伊春地区生长的羊肚菌菌种，本文对该菌种的菌丝生长所需的碳源、氮源、酸碱度3个因素进行单因素试验，以期为伊春地区发展羊肚菌产业提供理论依据。

1 材料

1.1 供试菌株

供试菌种为经栽培试验后筛选出的适宜在伊春地区生长的羊肚菌品种，该品种引自河南郑州，为六妹羊肚菌(Morchellaseptimelata)。

1.2 培养基

菌种分离及保存培养基：

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。

液体基础培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，pH自然，水1000 mL。

1.3 试剂

国产分析纯试剂：葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母浸膏、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、浓盐酸、氢氧化钠；国产食品级试剂：黄豆粉。

1.4 仪器与设备

AL-104高精度电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DZB-718便携式多参数水质分析仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台 苏州广源净化科技有限公司；HZ-2111KB立式震荡培养箱 金坛市盛蓝仪器制造有限公司。

2 方法

2.1 菌种活化与接种

将原始菌种接种到PDA 斜面培养基中，放入20 ℃恒温培养箱中培养7天，对其进行传代活化。

150 mL培养液装于250 mL三角瓶中，灭菌。无菌条件下，在活化的菌种上挑取大小一致的10个接种点分别接入到制备好的各种培养基中，摇床设置转速150 r/min、温度20 ℃，培养7天。

2.2 菌丝生长速度测量

选取活化后菌丝生长旺盛、菌丝生长速度一致的菌种，挑取2 mm×2 mm左右的接种点接种于PDA斜面上，10个重复，放置于恒温培养箱中进行培养，温度20 ℃。每天观察菌丝密度、颜色变化并测量菌丝生长长度，至菌丝长满试管为止。并根据测得的菌丝生长长度和培养的天数计算出每日生长速率。

2.3 碳氮源对菌丝体生物量的影响

以液体基础培养基中的葡萄糖和蛋白胨含量为标准，用相同质量的乳糖、蔗糖、可溶性淀粉代替基础培养基中的碳源，用相同质量黄豆粉、酵母粉、尿素代替基础培养基中的氮源，150 mL培养液装于250 mL三角瓶中，3个重复，灭菌，接种，培养。将培养结束后的发酵液倒入抽滤瓶中，进行抽滤，抽滤过程中流动地加入些许蒸馏水对菌丝体进行冲洗，抽滤后得到较干的菌丝体，再放置于烘箱中，温度设置为70 ℃，待完全烘干后，称量菌丝体生物量[4]。

2.4 pH对菌丝体生物量的影响

用NaOH 和HCl将液体基础培养基的pH值调为4个梯度，分别为6、6.5、7、7.5，灭菌后接种。每个梯度重复3次，培养方法及菌丝体生物量测量同2.3。

2.5 统计学分析

采用SPSS21统计软件进行数据处理和分析。

3 结果与分析

3.1 菌丝生长速率分析

由图1可知，菌丝每日生长速率呈明显上升趋势。接菌1天后，菌种全部萌发，菌丝洁白纤细稀疏，平均生长长度为4.58 mm左右；接种2天时，菌丝较密；接种4天时，全部满管，菌丝浓密,菌丝生长速率达到20.81 mm；接种5天时，气生菌丝较多，且爬上斜面上部玻璃；接种6天时，表面出现白点状菌核。

图1 每日菌丝生长速率

3.2 碳源和氮源对菌丝体生物量的影响

由表1所示，该菌种在4种碳源中均可生长，菌丝生物量和菌丝生长状态存在明显差异。以4种碳源为培养基的菌丝生物量从大到小依次为葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉，且葡萄糖与其它3种碳源在0.05水平上存在显著性差异；在以葡萄糖、蔗糖为碳源的培养基颜色呈浅黄色，在以乳糖、可溶性淀粉为碳源的培养基颜色呈褐色。综合菌丝长势，此种羊肚菌的最适碳源为葡萄糖。

表1 碳源对菌丝生长的影响

3.3 氮源对菌丝体生物量的影响

由表2所示，4种氮源均可提供该菌种生长所需的氮源，且菌丝生物量从大到小依次为酵母浸膏、豆末、蛋白胨、尿素，这4种氮源在0.05水平上存在显著性差异；在以酵母浸膏、豆末为氮源的培养基颜色呈褐色，在以蛋白胨、尿素为氮源的培养基颜色呈浅黄色。综合菌丝长势，最适氮源为酵母浸膏。

表2 氮源对菌丝生长的影响

3.4 pH对菌丝体生物量的影响

该菌种在培养基pH值为6.0、6.5、7.0、7.5四个梯度中的生长情况见表3，随着pH值由小到大，菌丝生物量不断增加、菌丝长势由弱变强、培养基颜色由浅变深。表明该菌种适宜在偏碱性的培养基中生长，四个梯度中7.5为最适pH值。

表3 pH对菌丝生长的影响

4 结论

通过液体培养对适宜伊春地区生长的羊肚菌菌种进行单因素试验，研究影响其菌丝生长的因素。不同碳源对菌丝生长有明显的影响，菌丝在葡萄糖培养基中长势最佳、菌丝生物量最大，其次是蔗糖培养基，再次为乳糖培养基，在可溶性淀粉中最差，且葡萄糖与其它各组对菌丝生长影响在0.05水平上差异显著。不同氮源处理对菌丝生长有明显的影响，菌丝在酵母浸膏中长势最好、生长速率最快，其次是豆末、蛋白胨培养基，尿素培养基最差，不适宜做该羊肚菌的氮源。在不同pH下，菌丝在偏碱性的环境下，长势良好，6.0、6.5、7.0、7.5四个梯度中，7.5为最适pH值。pH值大于7.5时，是否能使菌丝生物量增加，有待于进一步试验。试验结果表明：该羊肚菌菌丝生长最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母浸膏，最适pH值为7.5。