囊型肝包虫外囊壁中钙化性纳米微粒的分离培养和形态学观察

杨剑，彭心宇，张宏伟，杨靖，张永国，吴向未*

(1 石河子大学医学院第一附属医院肝胆外科，新疆 石河子 832002；2 华中科技大学同济医学院附属 同济医院肝脏外科中心，湖北 武汉 430030)

包虫病是一种危害严重的人畜共患寄生虫性疾病，它与结核病、艾滋病、疟疾等疾病一起被称为“世界上被忽视的疾病”[1]。在我国其主要遍布于新疆、青海、西藏等西部牧区和半农半牧地区，其中囊型肝包虫病患病率较高，占90%以上[2]。在囊型肝包虫病自然病程中，包虫囊肿经历着由小—大—小的过程，活性逐渐降低[3]。我们临床研究发现大多数肝包虫外囊壁会逐步发生钙化，且常伴有包虫内容物退化，生物学上称之为“非活跃期”，临床称之为“静止性病变”[4]；当肝包虫外囊壁钙化范围增大，虫体则大量死亡，这是因为外囊壁大范围钙化使得虫体很难从周围组织中摄取营养[5]。基于此理论，我们认为引起和促进肝包虫外囊壁钙化，可能成为治疗囊型肝包虫病新的方向，但目前国内外对于肝包虫囊壁钙化发生、发展机制认识尚不明确。有研究表明胆瘘的发生是一重要因素，其可在机体免疫机制作用下导致肝包虫囊壁钙化[6]。多年来国内外学者陆续从人体病理性钙化组织中分离获得钙化性纳米微粒，最新观点认为钙化性纳米微粒是一类能够自我复制的纳米级蛋白复合体，具有自我矿化的特性[7]。鉴此，我们提出假设：囊型肝包虫患者的胆汁中存在钙化性纳米微粒，由于肝包虫胆瘘的发生其纳米微粒可导致肝包虫外囊壁逐步发生钙化。本实验拟探讨囊型肝包虫囊壁钙化、包虫胆漏与钙化性纳米微粒的关系，分别从囊型肝包虫钙化及非钙化的外囊壁中试分离及培养钙化性纳米微粒，电镜观察该纳米微粒特征，初步寻找钙化性纳米微粒诱发肝包虫外囊壁钙化的证据及相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集 37例囊型肝包虫病患者于2018年1月至2018年12月在石河子大学医学院第一附属医院门诊确诊并住院行手术治疗，年龄43.5±7.6岁，其中女性为15例，男性为22例；术前CT明确包虫囊肿数目、大小、位置、WHO影像学分型及外囊壁钙化情况，术后明确手术方式、术中是否发胆瘘。本研究得到石河子大学医学院学术伦理委员会同意。

城市更新是一个由城市内部多种因素复合驱动的过程。城市更新的内容已从单纯“硬性”的物质和形体更新扩散到社会文化网络、邻里关系乃至人们的心理认同等“软性”更新。自改革开放以来，随着城市化速度的加快，我国的城市更新改造运动以前所未有的规模与速度展开。在城市更新中，既定的环境是城市政府所供给的制度和法律，需要重点考虑的是如何在多元化主体和差异化利益诉求下保证其顺利进行。

(1)术前CT判断肝包虫外囊壁钙化的程度由少到多为标准。

囊壁钙化进行分类：点片状，弧状，环状。

(2)胆瘘诊断标准。

1.3.1 透射电镜扫描-负染法

b：行开放式外膜内外囊切除术或次全切除术时囊壁内侧可见有胆汁渗入，囊内容物感染坏死，呈胆汁污染样颜色。

（2）进行电气设备配管下料时，必须要由专业的监理工程师进行施工监督，且施工的整个过程，都需要按照施工规范与设计规范进行相应施工，施工时若发现下料的材料不符合质量要求，必须进行更换，以确保电气设备的质量与安全性。

1.2 标本的处理

包虫外囊壁组织获取与处理。根据术中发现，将肝包虫囊肿分为胆漏组和非胆漏组，均用无菌剪取手术切除的外囊组织各2份(多点取材)。每份一部分剪成3 cm×3 cm，分别称取术中所取包虫外囊组织各500 mg，用无菌PBS洗净，直到无肉眼可分离见血水为宜，37 ℃烘干，充分研磨组织至匀浆状，0.1 mol·L-1盐酸加入摇匀，37 ℃、30 min孵育脱矿，每次间隔10 min摇匀，调pH至7.0～7.4(1 mol·L-1HCl-Tris加入中和)，在离心管中自然沉淀后，取上清20 mL转入离心机4 ℃、8,000 g，10 min离心，取上清液用0.22 μm 细菌滤器过滤约10 mL，56 ℃、30 min孵育去除支原体污染，4 ℃、12,000 g、离心40 min，再取上清液用0.22 μm细菌滤器过滤至15 mL试管中，每管2 mL，加入10%γ-PBS RPMI1640 4 mL作为培养基，放置于37 ℃、5%CO2条件下的细胞培养箱中进行培养，上述所有所取标本4周。

1.3 电镜标本的制作

由于普通光学显微镜难以鉴别纳米级的微粒，故应用电子显微镜观察已成为鉴定钙化性纳米微粒形态学的金标准方法，本实验方法主要运用电镜针对囊型肝包虫囊壁中分离、培养出来的钙化性纳米微粒进行观察和比较。

a：术中证实肝包虫破入胆道，胆道内可见囊内容物。

将肉眼观察有白色颗粒沉淀于管底的培养液，以16 000 g离心45 min，去上清，以PBS将沉淀冲洗，在4 ℃下应用2.5%戊二醛固定24 h，双蒸水5 min，3次洗涤，4 ℃、

12 000 g，离心40 min，加入1mLPBS制备混悬溶液，进行负染色，将铜网放置于混悬溶液上10 min，完全吸尽液体，在15 mol·L-1磷钨酸液滴上放置100 s，再次吸尽液体并晾干，在工作电压80 kV，H-7650透射电镜下予以观察。

1.3.2 扫描电镜

货币资金的国内外流动必然是伴随对外贸易投资活动的开展而进行的，本国经济发展停滞，则商贸活动减缓，货币流动必然随之而止，市场需求是一国货币走向国际市场的最根本动力，靠人为拉动或套利投机的货币国际化是不可持续的。丝绸之路上的古代货币的境外流通，完全就是市场需求带动的。因此，人民币国际化要在市场需求的基础上稳妥推进，无论是人民币的跨境贸易结算还是人民币的对外直接投资，都要注重海外市场的需求，现阶段可以重点扩大人民币的计价使用，真正发挥货币互换在贸易投资中的功能。

用2.5%的戊二醛将肉眼观察有白色颗粒沉淀于管底的培养液固定24 h，以PBS反复清洗3次，每次持续10 min，再用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇进行梯度脱水,各脱水10 min,到临界点进行干燥；以导电胶粘附样品放置样品台上，真空离子铂金膜喷镀，在工作电压25 kV和3 kV扫描电镜下予以观察。

中国是航运大国，世界10大港口中，中国占据8个席位。2017年，中国港口完成货物吞吐量140亿吨，比上年增长6%；完成集装箱吞吐量2.38亿标箱（TEU），比上年增长8.3%。2017年，外籍船舶靠泊中国港口数量超过28万余艘次，是1994年的5倍以上，而国际航行船舶燃油平均含硫量高达2.6%～3.5%，是车用柴油的3500倍，船舶燃油质量远远落后于陆上机动车燃油品质。上海市环境监测中心的数据显示，2012年，船舶排放二氧化硫、氮氧化物分别占当地排放总量的12.4%和11.6%，2015年分别上升到25.7%和29.4%。

1.4 统计学方法

实验数据用SPSS21.0进行数据分析,计数资料的组间比较采用卡方检验，以P<0.05为差异有统计学意义。本文均采用双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果与分析

2.1 囊型肝包虫外囊有无钙化与其胆瘘发生率的比较

1.2.3 食物成分调整 适当增加精神分裂症并2型糖尿病患者高纤维素等食物的摄入量，此类食物能够对胃排空的速度控制，从而将患者的餐后血糖水平降低。若患者存在胃瘫的情况，则应减少其高纤维素食物的摄入量，同时增加维生素C的摄入量[8]。

经过历代的治理，特别是新中国成立60多年来的大力治理，现在全国大江大河的防洪体系已基本形成，可以防御新中国成立以来发生的最大洪水。但是，全国绝大多数中小河流治理滞后，大雨大灾、小雨小灾频繁发生。目前全国大约有2/3的中小河流缺乏治理，防洪标准低于20年一遇~10年一遇洪水，达不到国家规定的防洪标准。

c：行“肝包虫外膜内外囊完整切除术”时证实囊壁外侧与囊周肝内胆管相通，或术后切开标本时发现囊壁或囊内容物呈胆汁污染样颜色等存在胆瘘的间接表现。

表1 囊型肝包虫外囊有无钙化的胆漏发生率比较

2.2 实验图片

2.2.2 组织获取与处理

术前CT显示囊型肝包虫囊壁钙化与术后证实囊型肝包虫胆漏发生的关系(图1～图4)。术前CT检查未见囊壁钙化的肝包虫，经手术切除后证实包虫囊内未见胆漏发生，而术前CT检查已明确囊内、囊壁钙化的肝包虫，术后证实囊内均存在胆漏的发生，囊内物坏死。

图1 囊型肝包虫CT(囊壁无钙化)

图2 术后证实肝包虫无胆漏发生

图3 囊型肝包虫CT(囊壁钙化)

图4 术后证实肝包虫有胆漏发生

2.2.1 术前CT图片

囊型肝包虫外囊壁组织获取与处理(图5、6)。选取囊型肝包虫钙化性外囊壁，分别剪成碎片样再将碎片钙化组织研磨成泥浆状，逐一进行脱钙、离心、过滤取上清液，加入10%γ-PBC RPMI1640 4 mL作为培养基，放置于37 ℃、5% CO2条件下的细胞培养箱中进行培养。

图5 肝包虫外囊壁组织获取

图6 肝包虫外囊壁组织处理

2.2.3 培养结果

CFG桩复合地基变形计算，首先按照JGJ 79—2012《建筑地基处理技术规范》第7.1.7条和7.1.8条确定复合土层的压缩模量和变形计算深度范围内压缩模量的当量值，再按GB 50007—2011《建筑地基基础设计规范》式（5.3.5）的有关规定计算复合地基变形。

经过四周培养，钙化的外囊壁组管底可见白色颗粒样沉淀(图7)，而无钙化囊壁组未见白色沉淀物(图8)。

图7 钙化外囊壁组管底见白色沉淀

图8 无钙化外囊壁组管底未见沉淀

2.2.4 透射电镜扫描结果

在收集的37例囊型肝包虫标本中，其中胆漏出现外囊壁钙化的有12例，有胆漏无钙化5例，无胆漏无钙化的20例，χ2=20.894，P<0.001，差异有统计学意义(表1)。

放置于透射电镜下观测，可见纳米颗粒存在，这种颗粒的形态大多数呈现肾形或者圆球形，直径约100～600 nm。

呈现出二分裂的形态，同时可见毛刺现象(图9、10)，随机选取透射电镜(负染法)为阳性的样本，进行超薄切片透射电镜观测，发现在颗粒外周有一层黑色致密物包绕(图11、12)，扫描电镜下观察这些颗粒大小不一，颗粒表面有类似结晶物(图13、14)。

图9 透射电镜下可见黑色颗粒

图10 透射电镜下呈二分裂的形态

图11 超薄切片电镜下颗粒外周黑色致密物包绕

图12 黑色颗粒外周可见毛刺现象

图13 扫描电镜颗粒大小不一，呈球形居多

图14 颗粒表面有类似结晶物

2.3 囊型肝包虫有无钙化性纳米微粒与其胆瘘发生率的比较

在收集的37例囊型肝包虫标本中，其中有胆漏培养出钙化性纳米微粒的有16例，有胆漏培养出无钙化性纳米微粒1例，无胆漏无钙化纳米微粒的20例，χ2=33.165，P<0.001，差异有统计学意义(表2)。

表2 囊型肝包虫有无钙化性纳米微粒的胆漏发生率比较

2.4 囊型肝包虫外囊有无钙化性纳米微粒与其胆瘘发生率的比较

在收集的37例囊型肝包虫标本中，有胆漏无钙化外囊壁培养出钙化性微粒4例，有胆漏钙化外囊壁培养出钙化性微粒12例，有胆瘘无钙化组未发现钙化性纳米微粒1例，无胆漏无钙化组未发现纳米微粒20例，χ2=33.740，P<0.001，差异有统计学意义(表3)。

表3 囊型肝包虫有无钙化性纳米微粒的 胆漏与钙化发生率比较

3 讨论

钙化性纳米微粒(calcifying nanoparticles，CNPs)[8]，是由芬兰科学家Kajander E.O等人在研究牛血清培养失败时意外发现的，在被发现的初期又称之为纳米细菌(nanobacteria，NB)，CNPs在自然界及人体的许多组织中普遍存在，其直径大约在100～600 nm之间，外形多呈圆球形或圆球杆状，在该颗粒外层有磷灰石矿化致密外壳，革兰氏染色呈阴性，代谢慢，耐酸、耐热。当前最新观点认为CNPs是一类能够自我复制的纳米级蛋白复合体，具有自我矿化的特性，CNPs在生理性钙、磷浓度中能形成羟磷灰石碳酸盐结晶，产生坚硬的矿化外壳覆盖于其周围，构成晶体核心，其分泌钙化脂多糖生物膜，具有较大的毒性，可引起细胞空泡形成、组织的炎症和肿胀，并出现一系列相关炎症因子的反应，因此与人类病理和感染性钙化疾病相关密切[7]。Larry W Hunter等[9]研究表明外源性CNPs在体外被主动脉平滑肌细胞吸收，并在矿化部位增强平滑肌源性凋亡小体的大量积累，加速血管钙化；吴基华等[10]实验研究表明CNPs可以作为结晶的活性核心，黏附、侵入并破坏肾集合管的上皮细胞和肾乳头细胞，形成磷灰石晶核，从而诱发肾结石形成；据李亚楠等[11]研究发现在61.3%患者胆汁中可分离及培养出来CNPs，并证实CNPs与胆结石的形成存在关系；多年来，国内外研究表明钙化性纳米微粒与钙化性主动脉狭窄、动脉粥样硬化、肾结石、慢性Ⅲ前列腺炎、多囊肝、胆囊结石、胎盘的钙化、类风湿性关节炎、慢性牙周炎、周围神经性病变等人体内组织的病理性钙化及慢性炎性疾病的发生与发展存在紧密联系[12-14]。而肝包虫外囊壁中钙盐的沉积被认为是机体局部反应而引起的营养不良性钙化[15]，营养不良性钙化是与感染，炎症，异物及细胞损伤密切相关，那么在肝包虫的自然病程中包虫囊壁的逐步钙化是否也与钙化性纳米微粒有一定关联？当前国内外均未见报道和研究，在本次实验中我们明确证实囊型肝包虫囊壁钙化与肝包虫胆漏发生存在一定关系(发现包虫囊壁出现钙化均有胆漏发生)，进一步从发生胆漏的囊型肝包虫钙化外囊壁中分离及培养出钙化性纳米微粒，其培养特性和电镜观察形态特征均与国内外文献相关信息描述高度一致，明确证实在肝包虫钙化外囊壁中同样存在钙化性纳米微粒，初步说明在囊型肝包虫自然病程中包虫囊壁钙化与钙化性纳米微粒可能存在一定相关性，但目前国内外未见有此相关报道；至于钙化性纳米微粒与囊型肝包虫囊壁钙化之间的具体关系和机制需进行深入研究和进一步探讨。

4 结论

(1)本实验首次在囊型肝包虫钙化外囊壁中分离和培养出与钙化性纳米微粒类似的纳米颗粒，明确证实囊型肝包虫钙化囊壁中存在钙化性纳米微粒。

如表1所示，模型组和丁酸钠组DAO和NO显著高于对照组（P＜0.05、0.01），丁酸钠组DAO和NO显著低于模型组（P＜0.05）。

(2)钙化性纳米微粒可能是导致囊型肝包虫外囊壁钙化的其中因素之一，可为我们研究囊性肝包虫病的自然病程和治疗囊型肝包虫病提供重要的补充和可能的思路。