生物炭基Rs-198菌剂对辣椒的耐盐促生性能研究

魏萌萌，刘啸尘，何艳慧，武占省,*

(1 石河子大学化学化工学院，新疆 石河子 832003；2 西安工程大学环境与化学工程学院，陕西 西安 710048)

近年来，新疆土壤盐碱化日益加重，严重影响了新疆地区农作物的生长和产量。利用根际促生细菌(PGPR，Plant growth-promoting rhizobacteria)开发有效促进作物生长、提高作物抗盐性的微生物制剂，已成为目前绿色农业可持续发展的研究热点，具有广阔的应用前景。PGPR是植物根际的菌群，具有维持健康的根部环境、营养吸收和缓解环境胁迫的能力，从而促进植物的生长和产量增长[1]。PGPR通过一系列直接和间接的机制促进植物生长发育，主要包括：固氮、溶磷、产生嗜铁素、植物生长调节剂、有机酸，以及酶如ACC脱氨酶、几丁质酶和葡聚糖酶等影响植物代谢，因此，被认为是一种缓解植物盐胁迫的有效方法[2]。恶臭假单胞菌Rs-198(Rs-198，PseudomonasputidaRs-198)是课题组前期从棉花根际筛选的菌株，经鉴定该菌株具有促生和缓解盐胁迫的功能。何艳慧等[1]以Rs-198为原料制备的微胶囊制剂，在盐胁迫条件下对棉花的生长有促进作用,发芽率和生物量均有显著提高，并可通过降低脯氨酸和丙二醛的积累来缓解盐胁迫。然而，根际土壤是一个复杂的微环境系统，游离的菌株易受土壤pH值、水分含量变化等的影响，因此，合适的载体对于提高Rs-198菌株的效率非常必要。

生物炭是生物质热解过程中的一种富含碳的副产物，因在固碳、减少温室气体排放、土壤改良、环境修复等方面的多种功能而受到越来越多的关注[3]。生物炭具有多孔结构、含碳量高、比表面积大的特性，施用到土壤中可以降低养分损失，提高肥料养分利用率[4]。Farhangi-Abriz等[5]的盆栽实验在3种盐水平下(0、6、12 dS/m的NaCl)使用3种不同比例的生物炭处理菜豆土壤(每盆重量比0、10%、20%生物炭)，结果发现，施用生物炭可提高菜豆地上部和根干重，并且有盐组中经过生物炭处理的土壤上幼苗中超氧化物酶(SOD，Superoxide dismutase)活性、多酚氧化酶(PPO，Polyphenol oxidase)活性和过氧化物酶(POD，Peroxidase)活性都有下降。生物炭具有较大的内部孔隙结构，可以为微生物提供暂时保护，减少线虫和原生动物的捕食并延长生存期[6]。Saifullah等[7]也报道了在盐胁迫下，生物炭和丛枝根菌联合使用比单独添加更有效地增加植物产量，主要是因为二者联用增加了植物的P和Mn的承受能力，并且改善了Na/K值。

本研究利用经济成本低廉的生物竹炭(BB，Bamboo biochar)作为载体，负载Rs-198菌株制备成生物炭基Rs-198菌剂(BBRs，Biochar inoculatedPseudomonasputidaRs-198)，通过研究菌剂对辣椒在盐胁迫下的生物量、生长指标、色素含量、渗透物质及抗氧化酶活性的影响，探究生物炭基Rs-198菌剂缓解盐胁迫的功效和机理，为农业可持续发展提供切实可行的方法。

1 材料与方法

1.1 Rs-198的发酵培养

将Rs-198(Rs)菌株接种到NA培养基中(牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L)，并在30 ℃下，以170 r/min的速率发酵24 h至稳定期以获得菌液。通过逐级稀释涂平板计数法测定发酵液中活菌数为1.86×109CFU/mL。

1.2 生物炭基Rs-198制剂的制备

竹炭(BB)购自乌鲁木齐新佳美图环保科技有限公司。粉碎后过100目筛。生物炭的理化性质：pH 9.91，EC 848.33 uS/cm，BET比表面积1.3 m2/g，平均孔径21.78 nm。高温灭菌后，5 g生物炭与2 mL的Rs-198菌液在无菌环境中混合，负载24 h。生物炭基Rs-198菌剂(BBRs)制备完成并保存在密封的聚乙烯塑料袋中。

1.3 辣椒种植和盐胁迫处理

辣椒品种是新疆昌吉市新科种子有限公司提供的红龙23号。将种子用95%乙醇灭菌5 min，用纯净水冲洗3次，然后用干抹布擦拭。盆栽土从石河子大学试验站取得，该土壤被归类为灰漠土，理化性质：pH8.08，EC688 uS/cm，速效氮128.33 mg/kg，速效磷69.16 mg/kg，速效钾363.73 mg/kg。盆栽实验在实验室光照培养箱中进行。

盆栽处理分为2组，无盐(0%NaCl)处理和盐(0.5%NaCl)处理，具体处理设置见表1。每盆土300 g，每盆10粒种子。每个处理种10盆。发芽后，保持水分，播种后10 d向盐处理的每个盆中添加100 mL0.5%NaCl溶液，期间定期补充蒸馏水，30 d后测量辣椒幼苗的生理指标。

表1 辣椒盆栽实验处理

1.4 辣椒幼苗指标测定

1.4.1 辣椒生物量和生长指标测定

30 d后，将盆中全部辣椒苗从土壤中轻轻拔出，冲洗干净，称量整株植物的质量，记为鲜重(FW)。用米尺测量幼苗株高和根长，用游标卡尺测幼苗茎的直径。记录叶面积。将叶片放入具塞比色管中4～6 h，取出擦拭水分，称重得饱和鲜重(SW)。然后将幼苗烘干至恒重，此时称重记为干重(DW)，计算相对水含量(RWC)[5,8-9]。

1.4.2 辣椒叶片叶绿素含量测定

辣椒叶片在提取剂(丙酮和乙醇体积比为2∶1)中放置过夜。叶子全部变白后，计算叶绿素a、b[10]。

1.4.3 辣椒叶片生化指标的测定

考马斯亮蓝G-250比色法测定叶片中的可溶性蛋白[5,8]。可溶性糖含量由苯酚法测定[11]。脯氨酸的含量通过磺基水杨酸法测定[5,8,12-13]。电解质渗透率(EL)测定参考[9]和[14]。

1.4.4 抗氧化酶的提取和活性测定

SOD活性采用四唑氮蓝光还原法测定[5,9,13,15]。PPO活性在398 nm处测量OD值[5]。POD活性测定是以每分钟内A470变化0.01作为1个POD的单位(U)表示[5,9,15]。

1.5 数据分析

数据结果为平均值±标准偏差。显著性水平为P<0.05下使用单因素方差分析(ANOVA)进行数据统计分析，然后进行S-N-K检验。数据分析和绘图软件通过Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 不同处理下辣椒的生物量

在0.5%NaCl组中，辣椒幼苗的株高、根长、鲜重、干重较0%NaCl组均受到抑制(图1)。

a—株高；b—根长；c—鲜重；d—干重。图1 不同处理下辣椒幼苗的生物量

在不加盐组中，与CK1相比，Rs1的株高、根长、鲜重、干重分别增加了6.81%、2.71%、33.33%、50.00%；BB1的株高、根长、鲜重、干重分别增加了30.41%、44.42%、39.22%、50.00%；BBRs1的株高、根长、鲜重、干重分别增加了37.47%、46.50%、56.86%、100.00%，且BBRs1的增加幅度大于Rs1、BB1，表明在土壤中添加菌剂，生物竹炭和Rs-198菌剂会增加植物的生物量，且二者联用具有协同作用。在0.5%NaCl组中，与CK2相比，Rs2的株高、根长，鲜重分别增加了4.65%，7.69%，7.41%；BB2的株高、根长、鲜重、干重分别增加了23.11%、9.40%、16.67%、25.00%；BBRs2的株高、根长、鲜重、干重分别增加了26.43%、24.27%、42.59%、50.00%。表明在土壤中添加菌剂，生物炭和Rs-198菌剂会提高辣椒耐盐胁迫的能力，且二者在盐胁迫下仍具有协同作用。因此，生物炭负载PGPR是一种促进作物生长的有效方法。

2.2 不同处理下辣椒的生长参数

辣椒的生长参数是辣椒幼苗生长情况的重要指标。图2显示了0%NaCl和0.5%NaCl胁迫下，不同处理对辣椒幼苗的茎粗、叶面积、叶片数和RWC的影响。不加盐组的结果可以看出，与CK1相比，BBRs1的茎粗、叶面积、叶片数和RWC分别增加了22.41%、31.55%、11.63%、5.14%，且BBRs1比BB1和Rs1增加的幅度大。在0.5%NaCl组中，与CK2相比，BBRs2茎粗、叶面积、叶片数和RWC增加23.41%、14.03%、12.79%、3.54%。表明在土壤中添加炭基菌剂会改善辣椒的生长参数。

a—茎粗；b—叶面积；c—叶片数；d—RWC。图2 不同处理条件下辣椒的生长参数

2.3 不同处理下辣椒的色素含量

从图3可以看出盐胁迫会降低叶片中叶绿素的含量。0%NaCl条件下，与CK1相比，BBRs1处理后，叶绿素a、b增加了28.33%、26.67%。与BB1和Rs1相比，BBRs1并没有显著的效果。0.5%NaCl条件下，BBRs2处理后，叶绿素a、b增加了47.22%、62.50%，而BB2和Rs2并没有显著增加辣椒叶片的叶绿素a、b的含量。因此，不论在非盐胁迫还是盐胁迫条件，添加BBRs均有利于缓解盐胁迫、促进叶绿素的合成，并体现出协同增效的效果。

a—叶绿素a含量；b—叶绿素b含量。图3 不同处理下辣椒的叶绿素含量

2.4 不同处理下辣椒的生化指标

所有处理的可溶性蛋白含量加盐组较不加盐组都有大幅度增加，以更好地应对盐胁迫造成的影响。由图4a知，在0%NaCl条件下，土壤中施加BB1、Rs1对辣椒叶片的可溶性蛋白含量影响不大。在0.5%NaCl条件下，Rs2、BB2、BBRs2分别比CK2降低了15.65%、16.49%、33.07%。由图4b知，在0%NaCl条件下，Rs1、BB1、BBRs1的可溶性糖降低，但不显著。在0.5%NaCl条件下，BB2、Rs2的添加降低了可溶性糖的含量，BBRs2可溶性糖的含量降低了57.78%。这些结果表明，BBRs2处理能显著提高叶片的生物活性和植物的健康性，减少自由基的积累和对植物细胞的损伤。如图4c所示，在0.5%NaCl盐胁迫下，其脯氨酸含量显著高于不加盐组，说明盐胁迫使得植物需要积累大量的脯氨酸以抵抗盐胁迫。在无盐条件下，各处理的脯氨酸没有显著性变化。在0.5%NaCl的盐胁迫条件下，Rs2、BB2和BBRs2分别降低了植物脯氨酸18.29%、45.12%、62.20%的含量，较好地保持了细胞渗透平衡。从图4 d可以看出，在0.5%NaCl胁迫下，辣椒叶片的EL增加，说明盐胁迫会对植物产生不利影响。但是在使用BBRs2后，EL降低了36.88%，Rs2和BB2也有所降低，表明BB2、Rs2、BBRs2均可以降低辣椒植物的电解质渗透率，提高植物体内金属离子与外界的交换能力，避免盐离子的积累。

a—可溶性蛋白；b—可溶性糖；c—脯氨酸含量；d—电解渗透率。图4 不同处理条件下辣椒的生化指标

2.5 不同处理下辣椒的抗氧化酶活性

BBRs通过降低SOD、PPO和POD的活性来消除应激的负面影响。图5a结果表明，在0%NaCl条件下，Rs1对SOD降低并不显著，而BB1、BBRs1分别降低了32.68%、39.46%。在0.5%NaCl条件下，Rs2降低SOD效果不显著，但BB2、BBRs2显著性降低了25.87%、35.68%。图5b结果表明，在非盐胁迫和盐胁迫条件下，各处理对PPO降低效果均不显著。图5c结果表明，在0%NaCl条件下，Rs1对POD降低并不显著，而BB1、BBRs1分别降低了28.81%、42.33%。在0.5%NaCl条件下，Rs2降低POD效果不显著，但BB2、BBRs2的POD活性显著性降低了32.09%、37.20%。

a—SOD活性；b—PPO活性；c—POD活性。图5 不同处理下辣椒的抗氧化酶活性测定

3 讨论

本研究中，施加BBRs可以协同生物炭和Rs-198的功能增加辣椒的株高、根长、干重和鲜重(图1)；茎粗、叶面积、叶片数和RWC(图2)，并且BBRs缓解盐胁迫效果显著，说明生物炭负载耐盐菌剂可以发挥二者的优势，缓解盐胁迫，协同促进植物生长。Hammer等[16]用针叶树木屑球为材料制备的生物炭和丛枝菌根真菌(AMF)二者单独施用具有缓解盐胁迫，提高莴苣的植株和根的干重的效果，二者联用效果更显著。Farhangi-Abriz等[17]研究表明生物炭在盐胁迫下可以提高豆科植物的叶面积和RWC。生物炭通过直接和间接的机制促进植物生长，向植物提供矿物质养分(Ca、Mg、P、K、S)是直接的，而改善土壤的物理、化学和生物特性从而促进植物生长是间接的机制。生物炭影响土壤pH、养分有效性、养分循环、离子交换能力和缓冲能力。何艳慧等[1]研究过Rs-198具有缓解盐胁迫促进棉花生长的功能，而Rs-198则会通过固氮、溶磷、分泌IAA等植物激素促进植物的生长。BBRs1、BBRs2处理后，叶绿素a分别增加了28.3%、47.22%，叶绿素b分别增加了26.67%、62.5%。与无盐组比，在盐胁迫下辣椒的叶绿素含量降低(图3)，是因为盐通过阻止植物对镁和铁等基本元素的吸收来抑制叶绿素的合成[10]。

土壤过量的盐分会导致植物产生活性氧(ROS，Reactive oxygen species)的积累，进而影响植物细胞生长和产物的积累。植物具有有效的活性氧清除系统，保护其免受破坏性氧化反应的伤害。抗氧化酶是活性氧清除系统中最重要的酶类，也是植物抗盐机制的重要因素。植物体内过量的ROS可以被SOD、POD、PPO等酶清除。SOD能将氧自由基(O2·-)代谢为过氧化氢(H2O2)，从而保护细胞不受损害。POD主要位于细胞外基质和液泡，在催化H2O2生成H2O和O2·-方面起重要作用。植物在盐胁迫下通常会积累酚类化合物，PPO活性的升高会提升植物细胞内氧化和降解有毒的酚类化合物的能力[5]。植物细胞渗透调节和积累有机溶质的能力是耐盐机制的另一个主要因素。植物组织中游离脯氨酸、可溶性糖和蛋白质等关键渗透物质的积累可以作为渗透调节对胁迫耐受程度的表征。可溶性糖主要由较大碳水化合物分子的分解而获得，在盐胁迫下水平升高的原因是维持细胞渗透压平衡、避免细胞失水，同时保护了细胞膜和其他细胞结构免受盐胁迫的负面影响[12]。在盐胁迫条件下植物可溶性蛋白含量和可溶性糖增加，能够提高植物细胞的渗透调节能力，降低植物的损伤程度[10]。脯氨酸是微生物、动物和植物对抗活性氧抑制作用的主要非酶抗氧化剂之一[5,8]，在调节植物细胞的渗透势、保护亚细胞结构和大分子免受渗透胁迫等方面具有重要作用。此外，它通常被认为是一种有效的活性氧清除剂，与防止凋亡有关[18]。盐胁迫程度越高，植物体内积累的脯氨酸含量越高，以保持细胞渗透压，防止细胞脱水。

不加盐组中，可溶性蛋白、可溶糖、脯氨酸和电解质渗透在处理后较空白对照CK1降低了。0.5%NaCl条件下比无盐条件的可溶性蛋白、可溶糖、脯氨酸和电解质渗透都升高了，但是在加Rs-198，BB和BBRs后，可溶性蛋白、可溶糖、脯氨酸和电解质渗透率都降低了(图4)。说明渗透胁迫对辣椒植株细胞有很大的缓解作用。这一结果与Lashari[18]的两年田间试验，在盐胁迫土壤中施加的生物炭堆肥降低了可溶糖、脯氨酸和电解质渗透率的含量的结果是一致的。孟长军[19]的研究也表明，相对电导率越大，膜透性越大，质膜受损伤的程度越高。电解质渗透率反映细胞膜透性的大小，而膜透性又直接反映植物细胞对细胞内环境的稳定能力和对外界环境的适应和抵御能力，是抗渗透胁迫的主要生理指标之一。因此生物炭负载菌剂的改良不仅可以有效地降低植物盐胁迫，而且对植物的生化过程也同样重要[18]。

结果表明，无盐条件下，生物炭基菌剂会降低SOD、POD和PPO含量，生物炭基菌剂处理的SOD、POD和PPO在盐胁迫下也分别降低(图5)。Farhangi-Abriz等[5]也报道了无盐条件下10%的生物炭降低了SOD和PPO，虽然盐度增加了大豆幼苗SOD、PPO和POD酶的活性，但是施加生物炭后降低了。BBRs通过降低SOD、POD和PPO的活性来消除应激的负面影响，认为BBRs在应激条件下具有防御作用[12]。

4 结论

生物炭基菌剂BBRs在非盐和盐胁迫下均促进辣椒生长并缓解盐胁迫。在0.5%NaCl盐胁迫下，生物炭基菌剂处理显著提高了辣椒的生物量、生长参数和色素含量，降低了辣椒的生化指标和抗氧化酶的活性。表明BBRs通过降低渗透物质和抗氧化酶的积累缓解了盐胁迫，可以有效清除盐胁迫引起的氧自由基，促进辣椒生长，为解决盐胁迫问题提供了思路和方法，有利于农业的可持续发展。