血清中miR-1181表达水平与鼻咽癌预后的相关性分析

姚梦纤谢辰庄志祥

鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma NPC）是临床上常见的恶性肿瘤，发生在人体的鼻咽腔顶部和侧壁，临床上以放疗为主[1]。多数地区NPC患者放疗的5年生存率仍不高，仅为40%[2]，仍对居民生命健康构成严重威胁。NPC 5年生存率不高的原因可能与发现时机、肿瘤分期、病理类型及治疗方案等诸多因素有关[3]。治疗前，若能有效预测NPC的预后，便于临床上及时调整治疗方案，而目前临床上用于NPC预后判断相关指标的特异度和灵敏度仍不高，无法满足临床诊疗需求[4]。因此，寻找一种有效预测NPC预后的生物标记物尤为重要。近年来，miRNA作为研究热点，其中miR-1181参与多个肿瘤的发生发展，其表达水平与预后有关[5]。miR-1181是否会影响NPC的预后，目前鲜有报道。本研究通过分析72例鼻咽癌患者的miR-1181表达水平，探讨miR-1181表达水平与患者预后的关系，为临床治疗鼻咽癌预后判断提供参考。现报道如下。

资料与方法

1 临床资料

选取2013年2月～2014年9月因鼻咽癌到我院进行治疗的72例患者作为研究对象。纳入标准：①符合西班牙医学肿瘤学会鼻咽癌临床指南（2017）[9]的鼻咽癌临床诊断标准；②患者均未进行放疗、化疗等特殊治疗；③患者自愿签署知情同意书。排除标准：①合并其他肿瘤者；②合并严重心、肺功能不全者；③合并严重凝血功能障碍者；④不积极配合本次研究者。将72例患者纳为观察组，采集患者血清，并收集临床资料。另选同期在我院体检正常体检，一般资料与观察组均衡的72位健康人作为对照组，采集血清。观察组男32例，女40例；年龄35～76岁，平均（54.26±12.28）岁；对照组男57例，女15例；年龄34～79岁，平均（53.86±11.88）岁。所有鼻咽癌患者根据WHO分类标准[10]进行分期，Ⅰ期15例，Ⅱ期17例，Ⅲ期18例，Ⅳ期22例。本研究经我院伦理委员会审核通过。

2 静脉血采集及血清提取

收集两组清晨空腹静脉抽血约5ml到抗凝血液基因组DNA提取试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司），在2～8℃下保存。将观察组及对照组的静脉血分别与Hanks平衡盐溶液培养基按比例（1:1）混合，混合后铺在分离液上。室温下对混合液进行离心（1200rpm/min），离心10min，将收集的第一层血清层溶于Trizol试剂，为RNA提取备用。

3 荧光定量PCR检测

将血清样本使用Trizol细胞浆裂解液溶解，荧光定量PCR实验使用Step-One系统进行处理。再根据逆转录试剂盒说明书，以U6作为内参，分别逆转录为cDNA，逆转录反应为25μL反应体系，反应条件为70℃10min，42℃50min，70℃10min，4℃保存。以U6作为内参，实时荧光定量PCR反应为25μL反应体系，反应条件为95℃15min，94℃15s、55℃30s、70℃30s，45个循环。本研究的PCR引物序列如下，miR-1181：Forward 5’-GCCGAGCCGTCGCCGCCA-3’，Reverse 5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6：Forward 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，Reverse 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。为分析miR-1181表达水平与鼻咽癌临床病理特征的关系，定义2-△OCT＞2为高表达，2-△OCT≤2为低表达[11]。

4 随访

从患者出院时间开始随访，随访结束时间为2019年9月31日，共随访5年。通过电话随访或者门诊的方式，了解患者的生存情况（包括疾病特异性生存、无转移生存、局部无复发生存），终点事件为删失、随访时间截止、死亡，总生存期为出院时间至终点事件时间。

5 统计学分析

结果

1 两组患者血清中miR-1181的表达水平

观察组miR-1181相对表达水平（3.56±1.04）与对照组miR-1181表达水平（6.57±2.21）对比，显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。根据定量荧光PCR血清miR-1181水平，将72例鼻咽癌患者分为血清miR-1181高表达组和血清miR-1181低表达组，见图1。

2 miR-1181对鼻咽癌细胞的影响

miR-1181的溶解曲线是单峰型，表明内参照的扩增产物结果较好，并没有出现其他非特异性产物或者引物二聚体。miR-1181的溶解曲线和扩增曲线见图2。

3 miR-1181表达水平与病理资料的相关性分析

结果显示miR-1181低表达与鼻咽癌患者淋巴结转移（P=0.002）、肿瘤分期（P=0.009）以及临床分期（P=0.001）密切相关，与患者的年龄、性别以及组织分化程度无显著相关（P＞0.05）。见表1。

表1 miR-1181表达水平与病理资料的相关性分析（例）

4 miR-1181表达水平与鼻咽癌患者生存率的关系

相关性分析结果显示，miR-1181的表达水平与鼻咽癌患者DSS（r=0.854，P=0.003）、MeFS（r=0.851，P=0.005）及LRFS（r=0.862，P=0.002）呈正相关。此外，DSS、MeFS及LRFS与患者的淋巴结转移、肿瘤分期及临床分期密切相关，与年龄、性别及组织分化程度无明显的相关性（见表2）。多变量生存分析结果显示，低表达组5年疾病特异性生存率、无转移生存率、局部无复发生存率均高于高表达组（HR=2.154，2.365，2.368；P=0.031，0.027，0.033）（见图3），表明miR-1181低表达是鼻咽癌生存预后的一个预测因子，预示着咽癌患者的DSS（P=0.031，HR=2.154）、MeFS（P=0.027，HR=2.365）及LRFS（P=0.033，HR=2.368）较差（见表3）。

表2单变量log-rank分析

注：各变量中DSS、MeFS与LRFS的病例有重合。

表3多变量生存分析

讨论

miRNA是大小长约20～25个核苷酸的非编码RNA，具有高度的保守性，在不同生物中起着相仿的生物功能[6]，被证实在细胞增殖、凋亡、激素分泌、及肿瘤分化、转移等过程起着重要的作用[7，8]。目前已证实的miRNA超过500个，预计总数超1000个，并且可调控人类基因的约占30%[9，10]。其中miR-1181参与多个肿瘤的发生发展，其表达水平与预后有关。

本研究发现miR-1181的表达水平与NPC预后有关，血清miR-1181水平越高，NPC预后越好。这可能与miR-1181生物调控功能有关。①miR-1181表达水平与STAT3状态有关[11]。目前STAT3是STAT家族最普遍存在的成员，被生长因子或细胞因子刺激后，作用于细胞核，以二聚体的形式与DNA片段特异性结合，调控目的基因转录[12]。STAT3在转录激活以及信号传导上均发挥重要作用，若信号通路被持续激活，会引起细胞恶性增殖、周边侵袭[13]。STAT3可通过各种靶基因（如血管生成因子、细胞周期调控因子、抗凋亡基因等）促进肿瘤的发展[14]。miR-1181表达水平与STAT3的表达水平呈负相关，NPC患者STAT3状态呈中高水平，易发生STAT3磷酸化（p-STAT3）,持续激活信号传导通路，参与肿瘤细胞的增值、转移[15]。②miR-1181表达水平与F-肌动蛋白(F-actin)状态有关[16]。F-actin通过调控细胞膜活动参与单核细胞的细胞免疫活动，经过合成分解调节机制对细胞膜进行控制，但此机制易遭到破坏，引起细胞异常生长、分裂、转移、增殖，导致细胞癌变[17]。miR-1181表达水平与F-actin的表达水平呈正相关，NPC患者中F-actin被剪切呈现低表达水平，导致其极性和运动结构的缺失，从而引起细胞的迁移能力变弱[18]。相关研究[19]显示Factin表达水平升高其肿瘤TNM分期均低于低表达患者，可能与F-actin高表达造成细胞活动能力升高有关，F-actin高表达越高，转移率越低，F-actin表达水平与肿瘤预后呈正相关。Hua X等[20]研究发现miR-1181下调，提示鼻咽癌预后不佳，并通过调节wnt/β-catenin信号促进细胞增殖和转移，与本研究结果一致。由于本研究样本容量较小，研究结果可能存在一定的偏倚，还需更大样本容量的研究进一步证实。

综上所述，miR-1181低表达与鼻咽癌患者预后不良密切相关，miR-118可能在鼻咽癌发生、发展及转移等起着重要的作用，可能成为鼻咽癌患者预后的生物标志物。