尾加压素Ⅱ促进毛乳头细胞增殖和迁移的实验研究

廖丛娟，张旭升，樊小容，谭小青，黄战军，蔡博治

1.深圳市龙岗区人民医院皮肤科，广东 深圳 518172；2.汕头大学医学院第一附属医院中心实验室，广东 汕头 515000

尾加压素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是一种生长抑素样环肽，最初是从鱼脊髓尾部脑垂体中分离而来，1998年首次从人脊髓中被克隆，是迄今为止发现的体内最强的缩血管活性肽，在体内具有影响脂质和葡萄糖代谢、刺激肾上腺皮质激素分泌等作用[1]。近年来研究发现，UⅡ是一种内源性促丝裂原，可促进体外培养的包括血管平滑肌细胞[2]、气道平滑肌细胞[3]、心脏成纤维细胞[4]、肾小球系膜细胞[5]在内的多种细胞分裂的作用。但UⅡ对体外培养的毛乳头细胞的增殖以及迁移的影响尚未见报道。本实验主要研究UⅡ对体外培养的毛乳头细胞生长及迁移的影响，并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 SPF级雄性SD大鼠由汕头大学医学院实验动物中心提供。DMEM高糖培养基、标准胎牛血清购自Gibco公司。胰蛋白酶购自Sigma公司。UrotensinⅡ(Rat，200 μg)购自康肽生物有限公司。CCK-8购自碧云天生物科技有限公司。Transwell 0.8 μm小室购自美国康宁公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠毛乳头细胞培养 将大鼠处死，取触须部皮肤，无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗干净，用显微剪分离出触须毛囊，放置于生理盐水中，将触须毛囊毛球部剪下，用Ⅰ型胶原酶消化2 h左右，在镜下观察到大量的毛乳头细胞游离出来，用含10%血清的DMEM培养基终止消化。离心去上清，将毛乳头细胞放入T25培养瓶中，37℃5%CO2条件下传代培养。实验用第2～4代细胞。

1.2.2 UⅡ对体外培养的毛乳头细胞增殖的影响 将第2～4代细胞消化、台盼蓝染活细胞计数，以3×103/孔的密度接种于96孔板内，放置于培养箱内培养24 h，待细胞贴壁后，每孔加入100 μL含不同浓度UⅡ的DMEM培养基，UⅡ的浓度分别为10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L，对照孔加入不含UⅡ的培养基，每个浓度设3个复孔。以铺板24 h记为测量的0 h，于48 h采用CCK8法测量各孔的OD值。测量时去除每孔的原培养液，悬空滴加含10%CCK8的新鲜培养基，于培养箱中放置1 h后，在酶标仪上测量波段为450 nm的OD值。细胞增殖率计算公式：增殖率=(含UⅡ实验孔OD值-空白对照孔OD值)/(不含UⅡ对照孔OD值-空白对照孔OD值)×100%。

1.2.3 Transwell实验检测UⅡ对毛乳头细胞体外迁移能力的影响 提前将细胞用不含血清的培养基饥饿培养12 h后，消化、计数，制备成1.0×106/mL的细胞悬液，往Transwell上室中接种0.1 mL细胞悬液，下室加入含10-6mol/L UⅡ的DMEM培养基500 μL，对照孔加入不含药培养基。于5%CO2培养箱内孵育24h后取出上室，用棉签轻轻拭去上室滤膜内面的细胞，对迁移至滤膜外面的细胞用甲醇在室温条件下固定20 min，结晶紫染色后，随机取4个视野(40倍镜)记录着色的细胞数。

1.2.4 细胞划痕实验检测UⅡ对毛乳头细胞体外迁移能力的影响 将毛乳头细胞接种至12孔板内，使细胞增殖至融合度为90%，使用无菌0.2 mL移液器套头笔直在细胞上划出一条伤痕，用PBS洗去死细胞，加入1 mL含10-6mol/L UⅡ的DMEM培养基，对照孔加入不含药培养基。在划痕后0 h和24 h拍照，在每条伤痕上随机选3个地方，用Image-Pro Plus软件测量直径后取平均数。创面闭合指数计算方法：24 h创面闭合指数=(0 h直径-24 h直径)/0 h直径×100%。

1.3 统计学方法 应用SPSS20.0统计软件分析数据，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 UⅡ对毛乳头细胞增殖的影响 如图1所示，不同浓度UⅡ (10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L)作用下，CCK8法测得的毛乳头细胞增殖率分别为(122±12.3)%、(141±4.4)%、(136±16.6)%、(137±15.6)%、(116±10.9)%、(109±10.8)%，其中10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L UⅡ显著促进毛乳头细胞增殖，分别与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

图1 CCK8法检测UⅡ对体外培养的毛乳头细胞增殖的影响

图2 Transwell法检测UⅡ对毛乳头细胞迁移能力的影响(×100)

2.2 UⅡ对毛乳头细胞迁移的影响 如图2A～2C所示，加药组的Transwell滤膜结晶紫染色结果明显比未加药组深，通过IPP软件计算着色的细胞数，结果显示加药组穿过Transwell滤膜的细胞数明显多于对照组(图2D)，说明10-6mol/L和10-7mol/L的UⅡ处理组都能显著促进毛乳头细胞迁移，分别与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。在划痕实验中，伤口愈合程度不同代表不同实验组细胞迁移程度的差异。如图3所示，随着时间延长，各组细胞的伤痕平均直径都越来越小。但是对照组的愈合程度明显低于UⅡ组，根据愈合指数计算，对照组及10-6mol/LUⅡ组24 h创面愈合指数分别为0.18±0.13、0.78±0.09，其中10-6mol/L UⅡ组明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明UⅡ可促进毛乳头细胞迁移。

图3 划痕实验检测UⅡ对毛乳头细胞迁移能力的影响(×100)

3 讨论

位于毛囊基底部的毛乳头细胞可诱导上皮细胞增殖分化形成毛囊，在毛发生长周期中起着重要的诱导、分化、维持和调节作用，对男性脱发症的发生和发展影响重大[6]。研究发现，将体外培养的毛乳头细胞移植入裸鼠体内，可诱导出大量毛囊和毛发纤维，形成肉眼可见的毛发，提示毛乳头细胞是产生毛发的关键细胞[6-7]。因此毛乳头细胞的体外分离培养及生物学特性是值得关注的。

许多研究证实，UⅡ对多种类型的细胞具有促增殖效应，WATANABE等[8]报道，UⅡ可促进血管平滑肌细胞中3H-胸腺嘧啶掺入，该刺激呈浓度依赖性，在UⅡ浓度为50 nmol/L时达最大效应，禹晓童等[9]发现UⅡ可通过介导肝脏干细胞内活性氧的水平从而促进细胞增殖，汪华林等[10]发现UⅡ通过影响细胞内钙离子浓度从而激活钙调速、蛋白激酶C、丝裂原活化蛋白激酶等多条途径，促进乳鼠肾小球系膜细胞增殖。这些研究均提示UⅡ是重要的促丝裂原，可通过多种机制诱导细胞增殖。另外，前期研究发现UⅡ具有促进血管外膜成纤维细胞迁移的能力[2]。然而UⅡ对毛乳头细胞增殖和迁移能力的影响目前尚未见报道。

本实验采用体外分离、培养的大鼠毛乳头细胞，进行CCK8实验、Transwell实验和划痕实验，观察不同浓度的UⅡ对毛乳头细胞增殖和迁移的影响。本实验的研究结果提示，一定浓度范围内的UⅡ可促进毛乳头细胞增殖，其特点是随着UⅡ干预浓度的升高，毛乳头细胞存活率呈现先增加后降低的趋势，其中10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L UⅡ显著促进毛乳头细胞增殖，上述结果与何艳华等报道的一定浓度的UⅡ可促进体外培养的大鼠心脏成纤维细胞增殖且促增殖能力随浓度先增加后降低的结论一致[11]。同时Transwell实验结果显示10-6mol/L、10-7mol/L UⅡ可促进毛乳头细胞迁移。在划痕实验中，10-6mol/L UⅡ组的细胞在24 h几乎达到完全愈合，愈合指数高达0.78，而对照组在48 h的愈合指数仅为0.18，差异具有统计学意义。由此可见，UⅡ不仅能促进毛乳头细胞增殖，也可以促进毛乳头细胞迁移。

综上所述，本研究以尾加压素Ⅱ作为干预因素，证明尾加压素Ⅱ能促进毛乳头细胞生长、增殖，还可提高毛乳头细胞的体外迁移能力，为揭示UⅡ的生物学效应提供新证据，为临床防治脱发提供一种新的策略与靶点。