生乳中L-羟脯氨酸含量测定的不确定度评定

李 均，卢 琳，魏 磊

（新疆兽药饲料监察所，乌鲁木齐 830063）

测量不确定度是用以表征合理赋予被测量的值的分散性，是测量结果含有的一个参数。在实际测量过程中，由于测量工具或是测量中各个因素的干扰，测得的结果是以一定的概率分散在某个区域内的多个值，测量不确定度是说明被测量之值分散性的参数。因此在测量的完整表示中应包含测量不确定度，根据实验室的需要，我们对生乳中L-羟脯氨酸的含量测定进行了测量不确定度的评定。

1 试验方法及步骤

1.1 称量及水解

准确吸取均匀的生乳样品5.00 mL 于水解管中，加入5.00 mL浓盐酸（优级纯）摇匀密封后，置于110 ℃恒温干燥箱中水解12 h。

1.2 转移定容

打开水解管，用滤纸过滤到100 mL 容量瓶中，用蒸馏水反复冲洗后定容。

1.3 调节pH

精密量取上述样品溶液10.00 mL 置三角瓶中，用浓度为10 mol·L-1和1 mol·L-1的氢氧化钠溶液调节pH 至8±0.2，用水转移到100 mL 容量瓶中，摇匀，作为供试品溶液待测。

1.4 标准曲线的配制

精密称取L-羟脯氨酸对照品50 mg（称准至0.000 01 g），用0.02 mol·L-1盐酸溶解并定容至100 mL，得标准储备液。吸取该标准储备液1.00 mL于100 mL 容量瓶中，用0.02 mol·L-1盐酸溶解并定容至刻度，得标准工作液。然后准确吸取标准工作液1.00、2.00、4.00、10.00 和20.00 mL 分别置于100 mL 容量瓶中，用水定容，摇匀，得到浓度分别为0.05、0.10、0.20、0.50 和1.00 mg·L-1的标准曲线。

1.5 显色及测定

分别吸取各浓度下的标准曲线溶液和供试品待测溶液各5.00 mL，分别置于25 mL 具塞比色管中，加入氯胺T 溶液2.00 mL，摇匀后于室温放置20 min，再加入显色剂2.00 mL，摇匀，盖上塞子于60 ℃恒温水浴锅中加热20 min 后取出，迅速冷却，用紫外分光光度计在560 nm 波长处测定吸光度值，并以标准溶液浓度值为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

2 数学模型

样品中L-羟脯氨酸的含量以质量浓度X计（mg·L-1），按下式计算：

其中，c：从标准曲线上查得的浓度（mg·L-1）；V1：吸取样品的体积（mL）；V2：样品水解后的定容体积（mL）；V3：吸取水解液的体积（mL）；V4：水解液调完pH后定容的体积（mL）。

3 各分量标准不确定度的评定

3.1 测量重复性的相对标准不确定度（A 类评定：标准差法）

为得到可靠性较高的结果，进行8份样品的平行测量，所得测量数据见表1。

表1 测量重复性的相对标准不确定度mg·L-1

利用上述数据，按照贝塞尔公式计算得单次测量的标准偏差为：

则以平均值作为测量结果时的实验标准差，即测量重复性的相对不确定度为：

3.2 标准曲线的标准不确定度

3.2.1 绘制标准曲线

为制作校准曲线，本次测量配制了6个不同浓度 的 标 准 溶 液c0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·L-1，对应的吸光度A分别为0.003、0.028、0.055、0.102、0.219和0.427。

用最小二乘法进行线性拟合，得标准曲线1次方程为：A-A0=0.4189c+0.0098，其相关系数r=0.9995。

3.2.2 标准曲线的标准不确定度

由于拟合直线本身具有不稳定性，用拟合直线计算样品中L-羟脯氨酸的含量所引入的标准不确定度按下式计算：

其中：p-试样平行测量次数；n-拟合直线的数据对总数；s(y)-单次测量的标准偏差；b-拟合曲线的截距；y-试样测量响应值（p个）的平均值；yˉ-绘制曲线响应值（n个）的平均值；Ci-绘制曲线用某标准溶液浓度值；Cˉ-绘制曲线用某标准溶液浓度输入值（n个）的平均值；Cs-从曲线上测得的样品中L-羟脯氨酸含量的平均值。

p=2，n=12，b=0.4189，yˉ=0.139，C=0.142，将这些数据代入公式（2）计算得到由标准曲线引入的标准不确定度：u(Cs)=0.631 mg·L-1。其相对不确定度为：

3.3 紫外分光光度计引入的标准不确定度

紫外分光光度计检定证书上说明在400～700 nm（由于本次测量波长为560 nm）范围校准的最大允许误差为0.55%，其包含因子k=2，则其标准不确定度为：

3.4 吸取样品的移液管相对标准不确定度

用5 mL的单标线吸管吸取5.00 mL(v1)，根据检定规程JJG-196-2009中的《常规玻璃量具》说明，5 mL A级单标线吸管的允许误差为±0.015mL，同样假定为三角形分布，其包含因子k=，则其相对标准不确定度为：

3.5 定容体积测量的相对标准不确定度

吸取试样水解后，转移至100 mL(v2)A 级容量瓶中定容，根据检定规程JJG-196-2009中的《常规玻璃量具》说明，100 mL A 级容量瓶的允许误差为±0.10 mL，假定为三角形分布，其包含因子k=，则其相对标准不确定度为：

3.6 分取体积的移液管相对标准不确定度

用10 mL的单标线吸管吸取10.00 mL(v3)，根据检定规程JJG-196-2009 中的《常规玻璃量具》说明，10 mL A级单标线吸管的允许误差为±0.020 mL，同样假定为三角形分布，其包含因子k=，则其相对标准不确定度为：

4 合成不确定度

将各分量的相对标准不确定度汇总于表2。

表2 输入量及其相对标准不确定度

计算氟苯尼考含量X的合成标准不确定度为：

5 扩展不确定度

取扩展银子k=2，得扩展不确定度为：

6 测量不确定度报告

测定结果：含量（mg·L-1）=5.79±1.308（±符号后为扩展不确定度，k=2，p=95%）。

7 讨论与结论

本文对生乳中L-羟脯氨酸的含量测定进行测量不确定度的评定，对6个影响分量计算各相对标准不确定度，得到合成标准不确定度为0.654（mg·L-1），算出本试验的扩展不确定度为1.308（mg·L-1）。通过评定不确定度，了解检测过程中的各影响因素，以减少其在试验过程中的影响。

其次，当检测结果处于检测边缘的时候，不同检测单位检测结果会存在一定的偏差，由于检测结果处于临近状态，使检测结果超出检测标准要求。如果进行检测结果不确定度的评定，给出不确定度值就可避免一些不必要的误差。最后，开展好测量不确定度的评定，是实验室提高出具检验结果可靠性的重要保障，也是实验室科学性、准确性和专业技术水平的体现。