n-3 多不饱和脂肪酸对大鼠下肢缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

周正，尉露露，杜秋瑶，李昌泽，董素淼，刘怀超，王涛，隋宏书

(1.山东第一医科大学临床医学专业，山东 泰安；2.山东第一医科大学生物化学教研室，山东 泰安；3.山东第一医科大学组织学与胚胎学教研室，山东 泰安)

0 引言

下肢缺血再灌注损伤(limb ischemiareperfusion，LIR)常见于急性动脉栓塞、腹主动脉瘤等手术治疗中长时间使用夹血带止血后再恢复血流的情况，是外科面临的常见难题，目前临床对LIR 尚无有效预防手段，有效的防护措施十分重要。有研究表明，n-3 多不饱和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids，n-3 PUFAs)具有抗炎、抗损伤的功能，对大鼠LIR 有一定的改善作用[1]。因此，本项目拟以n-3 PUFAs 为切入点，通过建立大鼠LIR 模型，研究n-3 PUFAs 对LIR 的干预作用，通过分子生物学、行为学等多种技术方法深入探讨n-3 PUFAs对LIR 预防作用，为临床诊治LIR 提供新的思路和手段。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，白介素8(Interleukin-8，IL-8)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Epoch 型号酶标检测仪购自BioTeK 公司，Chemeray240型号全自动生化分析仪购自深圳雷杜生命科技公司Neofuge15R 型台式高速冷冻离心机购自Heal Force 公司。

1.2 动物

48 只健康成年SD 大鼠，由山东第一医科大学实验动物中心提供，雌雄不限，体质量(190±5)g；于室温20°C，湿度55%的动物实验室内饲养14d，光照比白天：夜晚=12h：12h，饲养条件为每日更换水和垫料，满足大鼠的正常饮食需求。

表1 三组大鼠肢体对称功能评分

表2 n-3PUFAs 对LIR 大鼠氧化应激的影响

1.3 方法

1.3.1 大鼠LIR 模型的建立

SD 大鼠随机分为假手术组(Sham 组)16 只、下肢缺血再灌注组(LIR 组)16 只、n-3 多不饱和脂肪酸组(n-3 PUFAs组)16 只。n-3 PUFAs 组 给 予n-3 PUFAs(1g/kg/day) 灌 胃，连续14d。Sham 组、LIR 组每日灌胃等体积生理盐水，连续14d。各组采用Bulldog 无创血管阻断方法游离股动脉。假手术组不做夹闭股动脉处理。LIR 组、n-3 PUFAs 组钳夹股动脉将其游离出约10mm，在股动脉远端测血压，当测得血压为0 时说明缺血模型成功，缺血4 小时后去除动脉夹，恢复下肢血流，此时测得血压升高标志再灌注成功。假手术组、LIR 组、n-3 PUFAs 组完成操作后缝合伤口。

1.3.2 大鼠肢体对称性功能评分

将3 组大鼠置于大型透明圆筒状容器之中，正常大鼠表现为不时站立，并使用前肢触碰容器内壁，而下肢异常则会使大鼠站立频率降低。实验人员通过观察双侧后肢站立情况，并对比正常后肢的使用频率，可计算肢体使用率来衡量得分，每次评分间隔两天，每只大鼠重复10 次。肢体不对称评分=(正常后肢应用数-术后后肢应用数)/(正常后肢应用数+术后后肢应用数+双侧后肢同时应用数)×100%。

1.3.3 样本采集与检测

于14 天后处死大鼠，内眦静脉取血，离心后用于测定血清中MDA、IL-8、SOD 水平的测定。取患侧腓肠肌，使用10%中性甲醇固定，石蜡包埋，切片厚度5um，HE 染色，观察组织学结构及病理变化。

1.3.4 统计学方法

实验数据的处理均由SPSS 17.0 软件分析，计量资料以(mean±sE)表示。两组数据比较采用独立样本t检验；3组或以上的多样本间的数据比较采用单因素ANOVA，多重比较使用LSD 方法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠肢体对称功能评分

结果见表1。根据大鼠肢体不对称评分公式，得分越高表示大鼠肢体对称性越差。结合数据，在Day1 即建模完成时LIR 组和n-3PUFAs 组大鼠肢体对称性功能与Sham 组产生较大差异，且P＜0.05 差异具有统计学意义，表明建模效果良好。随着缺血再灌注时间的推移，大鼠肢体对称性功能逐渐恢复；Day4、10、13 可见在再灌注早期LIR 组(对照组)相比较n-3PUFAs 组(实验组)预后较差，有显著性差异。

2.2 大鼠腓肠肌组织比较

结果见图1。HE 染色显示Sham 组腓肠肌形态正常；LIR组可见肌纤维明显受损，出现肌丝不整齐排列，且细胞核数量明显减少，细胞出现坏死或凋亡；n-3 PUFAs 组可见肌纤维较LIR 组形态受损减轻；细胞核数量有所增多，坏死或凋亡情况减轻。

图1 三组大鼠腓肠肌样本的HE 染色(×25)

2.3 血清氧化应激指标比较

见表2。与Sham 组相比，LIR 组和n-3PUFAs 组大鼠血清中MDA 与IL-8 水平显著升高，SOD 水平显著降低，差异有统计学意义(n=16，P＜0.05)。与LIR 组相比较，n-3PUFAs组大鼠血清中MDA 与IL-8 水平显著降低，SOD 水平显著升高，差异有统计学意义(n=16，P＜0.05)。

3 讨论

下肢缺血再灌注损伤是外科手术中常见的病理过程，多见于游离组织转移，创伤截肢，外科手术耗时较长且手术阻断血流大于4h 再恢复血供后发生[2]。目前下肢缺血再灌注损伤的发生机制尚未完全阐明，但大部分研究发现血流再灌注过程中诱发的白介素等细胞因子大量释放，快速形成级联放大反应，导致局部组织能量代谢紊乱，细胞坏死和凋亡，不利于患者的术后康复，甚至造成更严重损害，这也是外科开展过程中有待解决的焦点问题[3]。

n-3 多不饱和脂肪酸的主要成分是二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)[4]。有大量研究表明EPA 和DHA 对花生四烯酸(AA)的代谢产生了显著的抑制作用，从而减少了AA 衍生的促炎因子二十烷类物质的释放[5]。本实验通过调整大鼠n-3PUFAs 的摄入量，使得n-6/n-3PUFAs 比值降低，减少了LIR 的氧化应激损伤，进一步说明n-3PUFAs具有对下肢缺血再灌注损伤保护作用。同时，也提示临床适量增加n-3PUFAs 的摄入或可成为一个安全有效的LIR 辅助治疗手段。

近年来，Berger MM[6]等研究表明n-3 PUFAs 可显著改善缺血再灌注后致炎因子白介素的升高[7]、抑制巨噬细胞内NF-κB 信号激活与其下游信号表达及抑制前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2) 诱发的细胞炎性反应过程[8][9]。MDA 是氧化损伤的最终产物，也是脂质过氧化的标志，可直接反应氧化损伤程度。为了探讨n-3PUFAs 对于下肢缺血再灌注引起的氧化应激的作用，我们检测了大鼠血清中的MDA、SOD 与IL-8 水平。在本实验LIR 组血清中SOD 活性显著下降，MDA 与IL-8 含量增加，这可能由大量氧自由基造成的酶活性抑制导致；n-3PUFAs 组SOD 活性较LIR 组明显升高，MDA 与IL-8 含量降低。提示n-3PUFAs 增强抗氧化能力可能是保护组织的一个重要原因。其具体的机制尚有待进一步明确。