冠突散囊菌散茶发花工艺提高茯茶品质

耶玉婷，苟拥军，李长风，骆娅婷，胡庆元，陈卫锋，孟永宏

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062；2.西安市长安区气象局，陕西西安 710199；3.陕西省生物农业研究所，陕西西安 710043）

茶叶以其采制时间不同可分为春茶、夏茶和秋茶[1]。夏秋季节气温高、日照强，细胞内代谢水平较高，茶叶中酚/氨比值较大，茶叶苦涩味重、口感差，品质不及春茶，但是其茶多酚、花青素、咖啡碱含量高，营养价值大[2]。如能通过加工技术改善夏秋茶滋味，提高大众接受度，将有效带动夏秋茶生产、提高茶农的经济收入。目前，降低夏秋茶苦涩味主要方法有以下3种：一是选择持嫩性好、酚/氨比低的鲜叶原料；二是通过遮阴、施肥等栽培手段改善茶叶品质成分[3-5]；三是通过加工工艺的改进来促进茶叶品质成分的转化[6-8]。试验利用微生物发酵技术，对茶叶成分进行转化，减少苦涩味，改善其滋味和口感，以期创新一种新型的茯茶制造工艺，开发有特色的夏秋茶新产品，最终促进夏秋茶资源的有效利用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

夏秋茶、茯砖茶，陕西泾阳茶厂提供；茯散茶，实验室自制。

没食子酸、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和没食子儿茶素没食子酸酯（GCG） 6种标准品，分析纯，Sigma公司提供；聚乙烯醇、葡萄糖对照品、石油醚（沸程30～60℃）、氧化镁、甲醇，色谱纯；18种氨基酸标品（茶氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸），分析纯，西安晶博生物科技有限公司提供；咖啡碱标准品，分析纯，陕西帕尼尔生物科技有限公司提供。

1.1.2 仪器与设备

755B型紫外可见分光光度计，西安盛大仪器设备有限公司产品；真空冷冻干燥器，北京四环科学仪器厂产品；高效液相色谱仪，美国Waters公司产品；全自动氨基酸分析仪，日本HITACHI公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 冠突散囊菌的分离纯化

参照胡治远等人[9]的方法，采用察氏培养基，从陕西泾阳茶厂茯砖茶中分离冠突散囊菌，于27.5℃下恒温培养，挑选长势较好的菌落，采取平板划线分离法，重复3～4次，得纯培养的冠突散囊菌株。-80℃冰箱中甘油管保藏。

1.2.2 “散茶发花”制作茯散茶工艺

将冷冻管菌种接入察氏培养基，27.5℃恒温条件下进行菌种活化。活化后的菌种接入PDA培养基，于27.5℃下恒温培养得到斜面菌种。以夏秋茶和夏秋茶质量50%的纯净水为种子培养基，27～29℃恒温条件下，将菌种接入种子培养基进行扩培，得到三角瓶菌种。在相同条件下接种到发酵曲盘进行发酵，培养周期根据预试验确定，然后在80～90℃条件下烘干。

1.2.3 茶叶水提取物的制备及其含量测定

精确称取20.0 g磨碎茶样，加双蒸水煮沸，水沸腾后煮茶3次，每次600 mL，每次30 min。趁热过滤，合并3次滤液，减压浓缩，于真空冷冻干燥机中干燥成粉末后，取出称量。得夏秋茶、茯砖茶、茯散茶水提取物分别为25.5%，25.6%，24.5%。

1.2.4 茶叶中多酚类物质含量的测定

（1） 茶叶中茶多酚含量的测定。采用Folin Ciocalteu比色法[10]，碱性条件下，酚类物质中的酚羟基能将Folin Ciocalteu试剂中的钨钼酸还原，生成蓝色配合物，颜色的深浅与多酚含量呈正相关。

式中：A——测试液吸光度；

V——样品体积，mL；

W——水提取物含量，%；

SLOPEstd——没食子酸标准曲线的斜率；

d——稀释因子；m——取样量，g。

（2）茶叶中儿茶素的测定。采用超高效液相色谱法[11]，色谱柱为Waters Acquity-BEH C18柱（1.7 μm，50 mm×2.5 mm）；流动相为乙腈和0.1%甲酸，采用梯度洗脱，乙腈洗脱质量浓度和时间为：9%（0）-9% （4 min） -12% （6 min） -25% （8 min） -9%（9 min） -9% （9.5 min），流速 0.25 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL，检测时间9.5 min，二极管阵列检测器，检测波长278 nm。

式中：C1——儿茶素质量浓度，μg/mL；

V1——样品总体积，mL；

W——水提取物含量，%；

m——试样质量，g。

1.2.5 茶叶中可溶性糖含量的测定

采用3,5-二硝基水杨酸比色法[12]，0.5 mL葡萄糖溶液中加入0.005 g/mL的3,5-二硝基水杨酸试剂1.5 mL，沸水浴中保持5 min，定容后放置20 min后测量，检测波长为550 nm。

式中：M1——查曲线所得水解后还原糖，mg；

W——水提取物含量，%；

d——稀释因子；

M——样品质量，mg。

1.2.6 茶叶中咖啡碱含量的测定

采用高效液相色谱法[13]，色谱柱为Symmetry C18Column（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温 30 ℃，检测波长275 nm，总流速1 mL/min，进样量20 μL，流动相A：乙酸与去离子水混合溶液（V乙酸∶V去离子水=1∶500）；流动相B：乙腈，梯度洗脱程序：0～30 min，90%A～60%A。

式中：C1——咖啡碱质量浓度，μg/mL；

V1——样品总体积，mL；

W——水提取物含量，%；

m——试样质量，g。

1.2.7 茶叶中粗脂肪含量的测定采用索氏提取法，参照GB/T 14772—2008。

式中：M2——提取前试样和滤纸的质量，g；

M1——提取后试样和滤纸的质量，g；

M——称取的试样质量，g。

1.2.8 茶叶中氨基酸组分的测定

参照GB/T 5009.124—2003，采用全自动氨基酸分析仪，内标法定量，测定氨基酸组分。采用高效液相色谱法[14]，色谱柱为Diamonsil C18（46 mm×250 mm，5 μm）；以乙酸铵溶液和乙酸铵、甲醇、乙腈的混合溶液 （V乙酸铵∶V甲醇∶V乙腈=1∶2∶2）作为流动相，流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温为25℃，检测波长338 nm，外标法定量，测定茶氨酸含量。

式中：C1——茶氨酸质量浓度，μg/mL；

V1——样品总体积，mL；

W——水提取物含量，%；

m——试样质量，g。

1.2.9 茶叶品质感官评价

参照GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》，对夏秋茶、茯砖茶、茯散茶的外形、汤色、香气、滋味和叶底进行特征描述和打分，总分按外形30%，汤色10%，滋味25%，香气25%，叶底10%加权平均计算。

茶叶评分标准见表1。

表1 茶叶评分标准

2 结果与分析

2.1 “散茶发花”制作茯茶

冠突散囊菌和压制后的茯散茶（冠突散囊菌（a），茯散茶 （b）） 见图 1。

由图1可知，冠突散囊菌菌落为较规则的圆形，颜色为金黄色，菌落中央厚度略高于边缘，中心有小隆起，结构较致密。

采用方法1.2.2中的散茶发花工艺，将菌种接入浅盘进行发酵，对发酵过程进行观察。

不同发酵时间的茯散茶见图2。

发酵第1天，茶叶无明显变化；发酵第2天，茶叶间有白色菌丝产生；发酵第3天，茶叶上出现大量黄色孢子，冠突散囊菌生长旺盛；发酵第4天，茶叶上均匀覆盖大量黄色孢子，发酵比较完全；发酵第5天，茶叶上金黄色的孢子颜色变暗，此时冠突散囊菌因发酵时间过长，产生大量褐色代谢产物。考虑到生产成本和发酵效果，散茶发花的发酵时间应控制在3～4 d为最佳。发酵成熟的茯散茶表面有金黄色孢子着生，发花均匀，具有明显发酵香味和陈香。为了方便饮用，将制成的茯散茶压制成型（见图 1（b））。

2.2 多酚类物质含量测定

采用1.2.4方法测量夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中的总多酚含量及儿茶素含量。

夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中茶多酚和儿茶素的含量见图3。

由图3可知，3种茶的多酚含量分别为11.9%，10.1%，8.0%。发酵后，茯砖茶多酚含量较夏秋茶下降了15.2%，茯散茶下降了32.6%，茯散茶的多酚含量下降幅度是茯砖茶2倍。此外，加工后的茯砖茶和茯散茶中儿茶素各组分变化较明显，茯砖茶中EGC，EC，EGCG，GCG，ECG分别降低了29.0%，5.3%，29.7%，45.4%，27.8%，其中GCG减少最多，C增加了12.6%，总体下降了8.8%；在茯散茶中EGC，EC，EGCG，GCG，ECG分别降低了29.6%，26.5%，74.3%，19.2%，61.7%，其中EGCG、ECG的含量下降最明显，C上升了24.3%，总体下降了19.85%。从儿茶素含量下降幅度来看，茯散茶是茯砖茶的2倍，这是由于“散茶发花”过程中，冠突散囊菌分泌胞外酶[15]，可加速茶多酚和儿茶素的生物转化，促进其氧化产物茶黄素、茶红素及茶褐素的形成与积累，导致茶叶中多酚类物质含量降低。

2.3 发酵对夏秋茶中可溶性糖、咖啡碱和粗脂肪含量的影响

茶叶中的糖类物质包括单糖、寡糖、多糖及少量其他糖类，对增进茯砖茶滋味的甘厚纯和口感具有十分重要的作用。对发酵4 d后的茯散茶，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测得3种茶中可溶性糖含量。

夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中可溶性糖、咖啡碱和粗脂肪含量见图4。

由图4可知，夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中可溶性糖含量分别为3.1%，3.0%，2.4%，即茯砖茶中可溶性糖含量在加工过程中下降了5.1%，茯散茶下降了24.1%，茯散茶下降幅度大约是茯砖茶的5倍。这是由于茯散茶在发花过程中冠突散囊菌大量繁殖，需可溶性糖作为碳源，进行代谢转化，满足自身生长发育。

咖啡碱，属生物碱类物质，是茶叶中含量最高的有机化合物，是茶叶的主要呈味物质和生理活性成分[16]。采用1.2.6方法对3种茶叶的咖啡碱含量进行测定。由图4可知，夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中咖啡碱含量分别为2.2%，2.6%，2.3%，茯砖茶较夏秋茶升高了18.6%，茯散茶中咖啡碱含量有所增加，但变化不大。Wang X G等人[17]研究表明，在茶叶发酵过程中，霉菌可以增加咖啡碱的含量，而酵母则降低其含量，因此茯砖茶中咖啡碱含量增加可能是由于在茶叶发酵过程中微生物繁殖产生代谢产物。

采用索氏抽提法对3种茶叶的粗脂肪含量进行测定。由图4可知，夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中脂肪含量分别为1.4%，1.3%，1.4%，茯砖茶相对于夏秋茶下降了6.3%，茯散茶相对于夏秋茶下降了1.7%。由此可以看出，茯砖茶和茯散茶在整个加工过程中，脂肪含量都变化不大。脂肪下降的原因可能是茶叶发酵过程中，微生物能分泌的脂肪酶能够将部分脂肪水解成脂肪酸，从而导致脂肪含量下降。

2.4 发酵对夏秋茶中氨基酸含量的影响

茶叶中富含多种氨基酸，茶氨酸是其中特殊的一种，为茶树的次生代谢产物，在一般植物中较为罕见。氨基酸是茶叶滋味与香气形成的重要前体物质，其组成、含量、降解产物和转化产物也直接影响茶叶品质，如其含量的增多能改善茯茶的鲜爽味[18]。采用全自动氨基酸分析仪，内标法定量，测定3种茶叶中的氨基酸组分。

夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中氨基酸组分含量见表2。

由表2可知，在茯砖茶和茯散茶加工过程中，各氨基酸组分的变化程度有所不同，但总体趋势都是下降的，分别下降了11.3%，42.6%。含量较多的茶氨酸（The）、谷氨酸（Glu）、天门冬氨酸（Asp）在茯砖茶和茯散茶中分别减少了37.4%，92.8%，且茶氨酸减少最多。其原因为茯茶在发酵过程中，以冠突散囊菌为主的一系列微生物,需消耗大量氨基酸来作为氮源和碳源，以满足自身生长繁殖和生命代谢，从而导致部分氨基酸含量下降。但是，人体必需的氨基酸蛋氨酸（Met）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His） 在茯砖茶中依次增加了21.1%，29.5%，7.6%，5.0%，在茯散茶中依次增加了41.5%，37.2%，24.4%，24.0%，这些氨基酸含量增加的原因是冠突散囊菌菌体和其代谢产物中新生成了部分人体必需氨基酸。

2.5 茶叶感官评价结果

表2 夏秋茶、茯砖茶、茯散茶中氨基酸组分含量/mg·kg-1

茶叶感官评价是判断茶叶品质优劣和品质特征的重要手段与方法[19]。根据GB/T 23776—2009茶叶感官评价方法，分别对夏秋茶、茯砖茶、茯散茶的外形、水色、香气、滋味和叶底进行特征描述并进行打分[20]。

夏秋茶、茯砖茶、茯散茶茶汤的感官评价雷达图见图5。

由图5可知，3种茶叶感官得分出现很明显的差别：夏秋茶得分最低，品尝时香气淡薄，以粗青气为主，茶汤有明显苦涩味；茯砖茶得分中等，以陈香为主，青气基本被转化，发花较好的茯砖茶带菌花香，苦味基本转化，略带粗涩味；茯散茶得分最高，香气以菌花香为主，出现陈香，滋味陈醇略厚，茶汤回甘明显。

茯散茶汤色鲜亮、滋味陈醇、回甘明显的主要原因有：一是茯散茶中更多的糖类物质通过脱水、缩合、聚合发生焦糖化反应，产生了更为怡人的汤色和焦糖香；二是茯散茶中水浸出物含量高，尤其是多酚类物质及其氧化产物含量丰富，多酚类氧化物茶褐素滋味稍甜，茶红素呈甜醇味[21]，且对发酵茶的红艳汤色有积极作用[22-23]；三是茯散茶中胞外酶及次生代谢产物会使儿茶素进行生物转化，降低了儿茶素对口腔的收敛与干涩刺激，有效改善了茶汤的滋味与回甘[24]。

3 结论

采用冠突散囊菌进行浅盘接种和散茶发花技术，4 d内即可完成茯散茶的加工过程。通过对夏秋茶、茯砖茶和茯散茶中几种主要成分含量的分析，发现散茶发花技术相比于传统加工技术更能彻底、有效地转化夏秋茶中多酚类物质、可溶性糖、脂肪、氨基酸，减少茶汤苦涩味，改善茶叶品质。该技术将对夏秋茶资源的有效利用，提高茶农经济收益和茶业发展具有重要意义。