淮山药RS3抗性淀粉制备及其消化特性

谢三都，陈惠卿，谢小伟，吴秀清

（闽南科技学院，福建泉州 362332）

淮山药（Dioscorea opposita），又称淮山，为多年生藤本植物薯蓣（Dioscorea opposita Thunb.）的块茎，在我国有2 000多年的种植历史，是卫生部公布的药食两用食物[1-3]，是福建省主要栽培的经济作物之一[4]，富含淀粉。淀粉是由直链淀粉和支链淀粉组成的高分子化合物，是大多数谷物的主要成分[5]。根据淀粉在人体内不同消化速度，淀粉可分为RDS、SDS和RS[6]。根据不同制备方法RS可分为RS1型（物理包埋法）、RS2型（天然抗性淀粉颗粒）、RS3型（老化淀粉）、RS4型（化学改性淀粉）。目前，制备淮山药抗性淀粉的方法主要以压热处理、湿热处理、韧化处理等物理方法为主[7-15]。

以淮山药为研究对象，采用酶解-压热法制备淮山药RS3抗性淀粉（Chinese Yam Resistant Starch-RS3，简称CYRS-RS3），在考查了淮山药淀粉乳pH值、普鲁兰酶用量、酶解时间、加热温度、加热时间及老化时间对淮山药RS3抗性淀粉得率影响的基础上，采用正交试验优化淮山药RS3抗性淀粉的制备工艺条件，并研究其消化特性，为将淮山药RS3抗性淀粉作为低热量、低糖量等食品的良好原料提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

淮山药，福建省山格农业综合开发有限公司提供，经去皮、护色、切片、烘干、打磨成粉后得淮山药粉。

1.1.2 试验试剂

普鲁兰酶（10万U/g），恒锐食品生物科技有限公司提供；α-淀粉酶（9 U/mg）、糖化酶（10万U/mL），上海源叶生物科技有限公司提供；C6H12O6、NaOH、 Na2HPO4·12H2O、 CuSO4·5H2O、 KOH、NaKC4H4O6·4H2O，天津市福晨化学试剂厂提供；KH2PO4，国药集团化学试剂有限公司提供；HCl，兰溪旭日化工有限公司提供；K4Fe(CN)6·3H2O、C16H18CIN3S，西陇科学有限公司提供。以上均为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

HH4型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品；上海雷磁PHS-3CpH计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品；FA2004型电子天平，上海衡平仪器仪表厂产品；BCD-168E/C型冰箱，海信科龙电器股份有限公司产品；101-1AB型电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司产品；Autoclave·GI36D型高压灭菌锅，厦门精艺兴业科技有限公司产品；TDL-60C型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂产品；SHA-B型恒温振荡器，国华企业有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 抗性淀粉制备流程

参考聂凌鸿等人[16]、阮思莲等人[17]、李宝瑜等人[18]、对淮山药RS3抗性淀粉制备方法的研究。准确称量2.00 g淮山药粉，转移至烧杯中，并按1∶9的比例（m/V） 加入蒸馏水配成淀粉乳。待搅拌均匀，用浓度为1 mol/L的盐酸溶液调节pH值至4.5，再加入一定酶底比（普鲁兰酶活力与底物质量比，U/g） 的普鲁兰酶液，在60℃恒温水浴锅中脱支处理一定时间。调节淮山药粉乳pH值在一定梯度范围内，放入90℃水浴锅中预糊化，同时灭酶处理5 min，在设定一定温度的高压灭菌锅中加热处理一段时间。取出后室温冷却，放于4℃的环境中，老化回生一段时间，取出样品涂片干燥、磨粉，过100目筛，即得CYRS-RS3成品。

1.2.2 抗性淀粉含量的测定

参考张丽芳等人[19]、Goni等人[20]抗性淀粉测定方法大致模拟人体内环境条件，先去除易消化淀粉，再用抗性淀粉溶解和酶解，最后测量样液的葡萄糖含量，以此计算CYRS-RS3得率。

式中：Q——淮山药抗性粗淀粉中CYRS-RS3得率，%；

X——测得试样中酶解葡萄糖的含量，g/g；

I——未经处理的淮山药粉还原糖含量，g/g；

m——称取的抗性淀粉样品，g；

0.9 ——葡萄糖质量与淀粉质量转换系数。

1.2.3 葡萄糖含量的测定

参考王启军[21]直接滴定法测定食品中还原糖含量：

式中：X——试样中酶解葡萄糖的含量，g/g；

A——碱性酒石酸铜溶液（甲、乙各5 mL）相当于葡萄糖的质量，mg；

m——样品的质量，g；

V1——测定时平均消耗未经酶处理样品溶液的体积，mL；

V2——测定时平均消耗经酶处理样品溶液的体积，mL。

1.2.4 消化率的测定

参考李涛等人[22]、琚长霄[23]根据In-vitro消化模型模拟人体的内环境，进行适当修改。在37℃恒温水浴环境中模拟人体体温环境，用胰α-淀粉酶以及糖化酶同时酶解CYRS-RS3，2种酶之间协同作用可抑制胰α-淀粉酶产物环糊精在模型中堆积导致酶活性的降低。再利用透析袋的半透膜特性使酶解的葡萄糖扩散于整个模型体中，以模拟人体肠道功能。再用直接滴定法测定烧杯中缓冲液葡萄糖含量，以此计算CYRS-RS3的消化率。

式中：V（平均）——5 h内CYRS-RS3平均每1 h样品消化的量，%；

I——未酶解的淮山药粉还原糖含量，g/g；

X——在整个模型取出的样品液中葡萄糖含量，g；

P——模型中取出的样品液体积，mL；

W——所用CYRS-RS3的质量（干基），g；

0.9 ——葡萄糖质量与淀粉质量转换系数。

1.2.5 单因素试验设计

（1） 普鲁兰酶用量。在淀粉乳中按酶底比为（0，90，180，270，360，450，540 U/g） 加入普鲁兰酶，酶解时间20 min，调节pH值6，在100℃压热温度下，加热处理时间20 min，待冷却后，4℃环境下老化时间16 h，测CYRS-RS3得率。

（2）酶解时间。在淀粉乳中按酶底比为180 U/g加入普鲁兰酶，分别酶解（0，5，10，15，20，25，30 min），调节pH值6，在100℃压热温度下，加热处理20 min，待冷却后，4℃环境下老化时间16 h，测CYRS-RS3得率。

（3） 淀粉乳pH值。在淀粉乳中按酶底比为180 U/g加入普鲁兰酶，酶解时间5 min，将淀粉乳pH 值调至 （5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5），在100℃条件下，加热处理20 min，待冷却后，4℃环境下老化处理16 h，测CYRS-RS3得率。

（4）压热温度。在淀粉乳中按酶底比为180 U/g加入普鲁兰酶，酶解时间5 min，调节pH值至6，分别在（90，95，100，105，110，115，120℃） 温度下，加热处理20 min，待冷却后，于4℃环境下老化处理16 h，测CYRS-RS3得率。

（5）压热时间。在淀粉乳中按酶底比为180 U/g加入普鲁兰酶，酶解时间5 min，调节pH值至6，在100℃温度下，分别加热处理（0，10，20，30，40，50，60 min），待冷却后，4℃环境下老化处理16 h，测CYRS-RS3得率。

（6）老化时间。在淀粉乳中按酶底比为180 U/g加入普鲁兰酶，酶解时间5 min，调节pH值至6，在100℃下加热20 min，待冷却后，于4℃环境下分别老化处理 （0，6，12，18，24，30，36 h），测CYRS-RS3得率。

1.2.6 CYRS-RS3制备工艺优化

基于上述单因素试验，以CYRS-RS3得率为指标，采用正交试验对淀粉乳pH值（A）、普鲁兰酶用量（B）、酶处理时间（C）、压热温度（D）、压热时间（E）、老化时间（F） 进行优化，确定制备CYRS-RS3最佳工艺参数。

正交试验制备CYRS-RS3工艺因素与水平设计见表1。

表1 正交试验制备CYRS-RS3工艺因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 淀粉乳pH值对CYRS-RS3得率的影响

不同淀粉乳pH值对CYRS-RS3得率的影响见图1。

由图1可知，CYRS-RS3得率随着pH值的上升先增后减，当pH值6时其产率达到最大值，为11.6%±0.096%（p＜0.01）；继续增大pH值，淀粉乳溶液逐步变为碱性，不利于抗性淀粉的形成，导致CYRS-RS3得率下降。因此，制备淮山药RS3抗性淀粉时其溶液pH值6.0为宜。

2.2 普鲁兰酶用量对CYRS-RS3得率的影响

采用普鲁兰酶处理淮山药粉时，其主要作用于淮山药淀粉的支链转化为直链淀粉，从而促进抗性淀粉的生成。

不同普鲁兰酶用量对CYRS-RS3得率的影响见图2。

由图2可知，CYRS-RS3得率随着普鲁兰酶用量的增加呈先增大后减少的趋势，当酶用量达到180 U/g时，CYRS-RS3得率最高为14.7%±0.15%（p＜0.01）。但继续增加普鲁兰酶用量时，支链淀粉脱支产生的短直链淀粉增加，不利于抗性淀粉的形成，CYRS-RS3得率反而下降。因此，制备淮山药RS3抗性淀粉时普鲁兰酶用量选择180 U/g左右为宜。

2.3 普鲁兰酶酶解时间对CYRS-RS3得率的影响

不同普鲁兰酶酶解时间CYRS-RS3得率的影响见图3。

由图3可知，采用180 U/g普鲁兰酶处理淮山药粉所得CYRS-RS3得率为13.6%±0.19%，明显高于未经酶处理的CYRS-RS3得率为9.5%±0.13%（p＜0.01），说明普鲁兰酶处理有利于抗性淀粉的生成。但酶处理时间过长，由于短直链淀粉的生成量加大，反而不利于抗性淀粉的生成，CYRS-RS3得率持续下降。因此，制备淮山药RS3抗性淀粉时普鲁兰酶处理时间选择5min左右为宜。

2.4 压热温度对CYRS-RS3得率的影响

压热温度足够高有助于淀粉的糊化，从而强化抗性淀粉的生成，但温度过高可能会使淀粉结构被破坏，从而弱化抗性淀粉的生成。

不同压热温度对CYRS-RS3得率的影响见图4。

由图4可知，当压热温度达到100℃时，CYRSRS3得率最高为14.9%±0.21%（p＜0.05）；增加压热温度，CYRS-RS3得率呈下降趋势。因此，制备淮山药RS3抗性淀粉时压热温度选择100℃左右为宜。

2.5 压热时间对CYRS-RS3得率的影响

热处理时间是保证淀粉能否完全糊化的主要因素之一。

不同压热时间对CYRS-RS3得率的影响见图5。

由图5可知，当压热时间达到20 min时，CYRS-RS3得率最高为16.9%±0.24%（p＜0.05）；继续增加压热时间，CYRS-RS3得率反而下降。因此，制备淮山药RS3抗性淀粉时压热时间选择20 min左右为宜。

2.6 老化时间对CYRS-RS3得率的影响

淀粉糊化后的老化在低温下进行，是一个淀粉分子链重排的过程，该过程进行相对缓慢。

不同老化时间对CYRS-RS3得率的影响见图6。

由图6可知，当老化时间达到18 h时，CYRSRS3得率增至最高值17.8%±0.21%，但与12 h时CYRS-RS3得率17.4%±0.20%无显著差异（p＞0.05）；继续延长老化时间，CYRS-RS3得率无显著变化（p＞0.05）。因此，制备淮山药RS3抗性淀粉时老化时间至少应该12 h以上为宜。

2.7 正交试验结果分析

CYRS-RS3制备工艺条件优化正交试验结果与分析见表2，正交试验结果方差分析见表3。

表2 CYRS-RS3制备工艺条件优化正交试验结果与分析

由表2可知，通过比较各因素极差R值大小，可知各因素对CYRS-RS3得率影响大小依次是E＞F＞C＞B＞D＞A，确定制备最佳因素水平为A1B3C1D3E3F4，即淮山药淀粉乳pH值5.5，普鲁兰酶用量为180 U/g，酶解时间5 min，压热温度109℃，压热时间20 min，老化时间18 h。

由表3可知，对CYRS-RS3制备的正交试验进行方差分析，其中加热温度因素在试验水平内对CYRS-RS3得率影响极显著（p＜0.01），老化时间因素在试验水平内对CYRS-RS3得率影响显著（p＜0.05），其他因素影响不显著。

表3 正交试验结果方差分析

以淮山药淀粉乳pH值5.5，普鲁兰酶酶用量为180 U/g，酶解时间5 min，压热温度109℃，压热时间20 min，老化时间18 h为制备CYRS-RS3的工艺参数进行验证试验，所得CYRS-RS3得率为20.7%±0.26%。

2.8 CYRS-RS3消化率

淮山药粉与CYRS-RS3在5 h内的平均消化率见表4。

表4 淮山药粉与CYRS-RS3在5 h内的平均消化率/%

由表4可知，CYRS-RS3平均消化率为8.22%±0.3%，比淮山药粉的平均消化率为12.7%±0.5%明显降低（p＜0.01），说明酶解-压热法所制备的抗性淀粉比原淮山药粉具有更强的抗消化能力。

3 结论

采用普鲁兰酶处理淮山药粉以制备淮山药RS3抗性淀粉过程中，淀粉溶液的pH值、酶用量、酶解时间等因素会影响CYRS-RS3得率。其中，当淀粉溶液处于适当的酸碱度时能提高淀粉乳中直链淀粉的释放，从而提高抗性淀粉得率，而碱性环境下，由于短直链淀粉的生成增多而不利于抗性淀粉的生成[24]；所采用的普鲁兰酶为脱支酶，作用对象为支链淀粉侧链脱支转化为直链淀粉，但酶处理过度，侧链脱支过多，产生短直链淀粉增多反而不利于抗性淀粉的生成[25]；酶解时间太长，同样会由于短直链淀粉生成量多而不利于抗性淀粉的生产[26]。

在抗性淀粉的制备过程中，需要将原淀粉进行充分的糊化，以利于淀粉分子链解绕释放直链淀粉，而淀粉糊化与其热处理温度和热处理时间息息相关。适当的热处理温度，能有效地将淀粉分子链打乱而后发生重新聚合、卷曲、折叠现象，同时有助于糖苷键断裂，以提高直链淀粉溶出率，从而增加抗性淀粉得率，但温度过高容易引起淀粉二级螺旋结构遭到破坏，内部疏水基团暴露，从而影响抗性淀粉生成[27]；而研究发现热处理时间不足，不利于直链淀粉从淀粉中分离，热处理时间太长，容易产生大量的短直链淀粉，其运动相对激烈，不容易结晶凝沉，不利于抗性淀粉生成[28]。

经糊化后的淀粉在低温条件下其直链淀粉分子之间会发生自动重排，形成双螺旋结构的结晶，从而制备出抗性淀粉，但此过程相对缓慢，需要较长时间才能完成，但老化时间太长也无助于生成更多的抗性淀粉[29]。

综上所述，采用酶解-压热法制备淮山药RS3抗性淀粉的最佳工艺条件为淮山药淀粉乳pH值5.5，酶用量180 U/g，酶处理时间5 min，压热温度109℃，压热时间20 min，老化时间18 h，且在该参数条件下的淮山药RS3抗性淀粉得率为20.7%±0.26%。运用In-vitro消化模型，测得最佳工艺下的HYRS-RS3在5 h内平均消化率为8.22%±0.3%显著低于原淮山药粉的平均消化率为12.7%±0.5%，结果表明以HYRS-RS3的为原料开发的新产品虽然具有一定抗消化特性，但试验过程发现该方法制得的抗性淀粉容易使成产品风味变得干涩、质地较硬，整体口感变差，且可能不利于保证新产品的色泽，因此在实际运用中需要进一步探究淮山药RS3抗性淀粉理化性质的改进。