微生物合成纳米硒的研究进展

杨 辉1,王丽红1,孔 阳1,苏 文1,贺 博

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安710021;2.安康市富硒产品研发中心，农业农村部富硒产品开发与质量控制重点实验室,陕西安康 725000)

研究发现[10-12],当单质硒处于纳米级(Se-NPs)时,具有特殊的理化性质,活性强、毒性低、吸收好,安全使用量高于无机硒和有机硒,是一种新型的补硒形态,具有良好的应用前景。本文综述了Se-NPs的特点,微生物合成Se-NPs的优势及微生物种类,并归纳了Se-NPs功能性产品开发的研究进展。

1 纳米硒的特点

纳米硒在结构和性质上具有独特的性质受到研究人员的广泛关注,主要特点如下:

1.1 纳米硒是红色单质硒,生理活性强

在未发现纳米硒以前,单质硒只有灰色、黑色之分,无生物活性,不能被生物体利用。我国研究者张劲松等[13-14]首次以VC为还原剂合成出了红色的纳米级单质硒,已证明红色纳米硒具有抗癌、抗菌、抗氧化、免疫调节等生理活性[15]。

1.2 纳米硒生物活性与粒径密切相关

研究表明[16-17]粒径在 5～200 nm之间的纳米硒才具有明显的生物学效应。Wang等[18]对比了35和91 nm两种粒径的SeNPs对癌细胞的抑制作用,Jia等[19]制备并比较粒径为 28、33、44、52 nm的SeNPs对宫颈癌HeLa细胞的抑制作用,结果均表明SeNPs抑制肿瘤细胞的增殖能力和粒径大小成反向关系,即粒径越小抑制癌细胞增殖能力越强。在体外抗氧化、小鼠肝损伤及糖尿病治疗方面,不同尺寸纳米硒的效果差异明显,赵胜男[20]对比60、80、100 nm纳米硒的作用,同样说明SeNPs粒径越小疗效越好。

1.3 蛋白质可增强纳米硒稳定性

纳米级的单质硒不稳定,具有较高的表面自由能,容易团聚,或转变成无活性的灰色或黑色单质硒,蛋白质可增强纳米硒的稳定性[21]。Sarkar等[22]利用一株链格孢菌Alternariaalternate的培养基滤液还原Se(VI)合成SeNPs,发现SeNPs得以稳定存在是因为表面包裹的蛋白质的保护作用。Dobias等[23]在大肠杆菌发酵液中分离出了结合在纳米硒上的蛋白质AdhP、Idh、OmpC及AceA,研究表明[24]蛋白质可为SeNPs的合成提供反应位点,还可吸附于纳米硒的表面形成包覆层,对纳米硒的稳定起重要作用,其中乙醇脱氢酶(AdhP)和SeNPs表面结合紧密,对SeNPs具有较强的保护作用,防止其聚集长大,制备中可控制纳米硒的粒径大小。

1.4 纳米硒使用安全性高

纳米硒急性毒性实验研究发现[15,25-26],对无机硒(亚硒酸盐)半数致死量LD50值为15.72 mg/kg BW,而纳米硒则为112.98 mg/kg BW。与有机硒相比,纳米硒同样具有较高安全性,Wang等[27]采用硒代蛋氨酸和纳米硒喂养小鼠,纳米硒半数致死浓度LC50为92.1 mg/kg,硒代蛋氨酸的LC50为5.6 mg/kg,说明纳米硒中毒的风险较低,而且纳米硒过量(0.2～0.4 mg/kg BW)对小鼠没有明显毒性[28]。因此纳米硒作为一种高活性、低毒的补硒产品将有望成为最佳的硒营养补充剂或治疗药物。

2 微生物合成纳米硒的优势

目前,纳米硒的合成方法主要包括物理法、化学法和生物法。物理合成法采用高温、高压或者激光催化等转化[29-30];化学法通过添加还原性试剂(如抗坏血酸、谷胱甘肽、碘化钾、硫代硫酸钠等)合成纳米硒和稳定剂(蛋白质、多糖、多酚类物质和淀粉等)[27,31]避免纳米颗粒聚合。生物合成法利用生物体在生长繁殖过程中产生的代谢产物或体内的酶系将无机硒还原成纳米硒。

很多微生物可将无机硒转化形成纳米硒。微生物还原硒的原理主要是利用微生物的同化还原、异化还原和生物群落甲基化等,将水体、底泥、土壤等环境中Se(VI)和Se(IV)合成SeNPs,Se(VI)和Se(IV)可以作为微生物厌氧呼吸中的电子受体,通过参与细胞呼吸或还原、甲基化等脱毒途径而被代谢,并在胞内积累或胞外分泌SeNPs[32]。因此微生物在硒的生态循环过程中起关键作用。与其它合成法相比,微生物合成纳米硒具有众多优势。

2.1 微生物转化纳米硒条件温和

微生物的生长环境最适温度在25～37 ℃,在其生长繁殖过程中合成纳米硒,而物理、化学法一般对条件要求较高,Mokhtar等[30]采用微波辐射合成纳米硒,辐射功率750 W,在肼及表面活性剂作用下合成SeNPs,反应需要高温环境。Triantis等[33]利用光产生的强反应活性制备出40、60、90 nm不同粒径的纳米硒颗粒,反应需要光激活氧化还原性。因此微生物合成纳米硒相比转化条件温和,无需特定设备,安全性高,环保经济。

2.2 微生物合成纳米硒颗粒结构稳定

物理法需要高温、高压、催化剂等技术,制备的纳米硒存在大小不均匀,生物活性差,结构不稳定性的现象[34];化学方法制备纳米硒颗粒易团聚,因此需要加入蛋白质、多糖等分散剂或保护剂,使纳米硒维持稳定结构和生理活性,程序复杂,易导致二次污染和纯化困难。相比微生物合成纳米硒颗粒对热稳定,不易转化为无活性的黑色或灰色单质硒,大小较为均一,呈规则的球状,为单一标准结构的纳米颗粒[35]。Fesharaki等[36]把肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)合成的SeNPs,在121 ℃下灭菌20 min,SeNPs没有发生变化,说明微生物合成的SeNPs结构更稳定,可以耐高温、高压。Kessi等[37]发现红螺菌(Rhodospirillumrubrum)合成的SeNPs外层包裹蛋白质,形成Se-蛋白复合物,蛋白质能够有效地避免无定形红色纳米颗粒发生转化,起到稳定剂作用。

2.3 微生物合成的纳米硒颗粒结构均匀,分散性好

研究发现化学合成SeNPs形状不规则且粒径相差较大,从20～50000 nm不等[38],目前物理化学法合成SeNPs在控制粒度大小和颗粒均匀上还有较大困难,因此也限制了SeNPs的工业化生产。微生物合成的纳米硒粒径多为17～500 nm之间[39-41],呈均匀、分散的球型。微生物在合成的过程中,菌体分泌的蛋白质或多糖等聚合物会均匀地包裹在纳米单质硒颗粒外,起到天然的稳定剂或保护剂的作用,因此纳米硒粒径均匀、尺寸稳定、分散性好。

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3 合成纳米硒的微生物种类

3.1 细菌

细菌具有代谢旺盛、繁殖能力强、营养要求低等特点,是研究微生物转化合成SeNPs的主要类群。细菌转化硒酸盐或亚硒酸盐合成SeNPs的研究较早,目前已经报道的既有厌氧菌又好氧菌,有光合细菌还有化能异养菌,均可以在菌体胞内或胞外多个位点还原亚硒酸盐和硒酸盐形成SeNPs。早在1981年,Sarathchandra等[42]在研究硒生物转化时发现巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)可以转化形成红色的SeNPs。目前国内外报道SeNPs的转化细菌较多,如粪肠杆菌(Enterobacterfaecalis)[43]、棒状菌属(Corynebacteriumspp.)[44]、乳酸菌(Lactobacillus)[45]、固氮红细菌(Rhodoacterazotoformans)[46]、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)[47]、假单胞菌(Pseudomonasalcaliphila)[48]以及铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[49]等。不同细菌在转化能力方面有较大差异,硒还原菌必须首先能耐受高浓度的亚硒酸盐或硒酸盐的毒性,才能在繁殖过程中通过解毒途径转化合成纳米硒,因此对细菌转化SeNPs的研究主要注重寻找高耐受硒毒性的纳米硒转化菌及优化菌体的培养条件,提高转化率[50]。目前对细菌合成纳米硒已经进入还原机理的探究,结果表明纳米硒在细菌内转化部位较广泛,细胞外、周质空间和细胞质内均可发生;既有酶促反应也有非酶促反应,但对于控制纳米硒形成的关键性基因、蛋白质或酶,硒进入细菌的途径及SeNPs的转运方式等许多内部还原机理问题等还在探讨中[51-52]。

表1 纳米硒的应用Table 1 Application of nano-selenium

3.2 真菌

真菌主要包括单细胞的酵母及多细胞的霉菌和蕈菌,对金属具有强的抵抗力和转化积累效果[53]。真菌合成纳米颗粒的研究较细菌稍晚,目前关于合成SeNPs的真菌报道还比较少,如木霉(Trichodermareesii)[54]、黑曲霉(Aspergillusniger)[54]、镰刀菌(Fusariumsp)[54]、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)[54]、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)[55]等。真菌合成的纳米硒可在胞内或胞外积累,不同菌合成纳米硒尺寸差异较大,Zare等[56]从土壤样本中筛选出一株土曲霉(Aspergillusterreus),在细胞外合成纳米硒颗粒,粒径约为47 nm。Vetchinkina等[57]发现香菇菌丝(Lentinulaedodes)可以还原转化亚硒酸钠为球形纳米硒颗粒,并在菌丝内积累,粒径大小在160～200 nm。

酵母可食用,富硒酵母安全性和生理活性较高,被认为是富硒的最佳载体,且生产周期相对较短,目前的研究主要关注利用食用酵母将亚硒酸盐或硒酸盐转化为有机硒[58],用于开发功能性营养补硒食品和防治药物,已在食品和饲料添加剂生产等方面得到良好应用[59]。但目前应用酵母转化合成纳米硒报道较少,主要针对酿酒酵母开展。Hariharan等[55]利用酿酒酵母在好氧条件下处理亚硒酸钠溶液形成高度稳定的硒纳米颗粒,纳米颗粒尺寸范围为30～100 nm。吴国杰[60]公开了一种纳米硒的制备方法,采用啤酒发酵的酵母泥转化亚硒酸钠得到粒径为30～40 nm的纳米硒颗粒。酿酒酵母转化纳米硒具有重要的应用价值,可应用于开发富硒啤酒、果酒,提高酒中纳米硒含量,因此筛选富纳米硒酿酒酵母具有重要意义。

3.3 放线菌

目前已报道合成SeNPs放线菌较少,Forootanfara等[61]筛选到一株放线菌Streptomycesmicroflavusstrain FSHJ31,菌株转化SeNPs的粒径范围介于28～123 nm之间。Tan等[62]从硒矿土壤中分离出一株好氧分枝放线菌菌株Streptomycessp.ES2-5,纳米硒尺寸在50～500 nm之间。目前发现的转化合成SeNPs的放线菌多为链霉菌属类[40,63],说明此类放线菌转化合成纳米硒的能力较强,可能在链霉菌属中含有较丰富的硒酸盐还原酶,因此链霉菌属是筛选转化纳米硒放线菌的主要类群。

3.4 原生动物

据报道原生动物也可以合成纳米硒,但目前仅Cui等[64]报道嗜热四膜虫(TetrahymenathermophilaSB210)可合成纳米硒,形成非晶态的球体纳米硒颗粒,直径为50～500 nm,并对SeNPs合成机理进行探索,发现有三种蛋白可能参与了SeNPs的合成过程。四膜虫细胞结构和功能复杂性是非常有价值的生物模型,利用四膜虫合成纳米硒为研究SeNPs合成机理奠定了基础。

4 纳米硒功能性产品应用的前景

纳米硒作为具有低毒、高效补硒和抗氧化、免疫调节、促进生长等药理作用的硒形态,开发纳米硒功能产品前景广阔,具体应用情况见表1。

4.1 纳米硒营养补充剂

补硒可以增强机体保护作用,调节机体的免疫功能,因此SeNPs在保健食品方面有着良好的应用前景。我国开发的“硒旺胶囊”主要成分为SeNPs,具有延缓衰老、免疫调节功能,已被国家卫生部正式批准为保健食品,在国内外硒营养补充保健品市场上具有强的竞争力。杨秀松等[65]采用贻贝提取物转化合成纳米硒贻贝粉,是良好的抗氧化剂和补硒制剂。纳米硒保健食品研发已受到人们重视,国家专利局公开或授权的专利有纳米硒锌全营养素生产功能保健食品、康比硒、富硒茶、纳米硒化牡蛎多糖固体饮料等[66]。

4.2 纳米硒药物的开发

纳米硒可通过清除自由基、激活抗氧化硒酶的活性、增强抗氧化防御体系等多种方式发挥抗氧化作用。Zhai等[68]报道壳聚糖包裹的纳米硒可清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和脂质过氧化物不同水平的自由基。纳米硒对一些难控制细菌、真菌感染也很有效,可用于预防和治疗金色葡萄球菌感染[43],抑制烟曲霉和白色念球菌的活性[69]。

4.3 纳米硒饲料的开发

作为动物用饲料添加剂,肠道的吸收效果非常关键,纳米级的单质硒颗粒小,比表面积大,与肠道粘膜接触面积大,因而吸收效率好、利用率高。研究表明添加SeNPs的饲料可以提高动物生长速度、抗氧化、免疫力等功效,已在鸡、鹅、猪、羊等畜禽中开展应用研究,但使用时需要严格控制纳米硒的加量,避免产生毒性反应。王福香等[70]将纳米硒喂养肉鸡,发现了纳米硒可以促进肉鸡的生长、提高抗氧化能力。邓岳松等[71]以亚硒酸钠、硒蛋氨酸和SeNPs为饲料添加剂,研究尼罗罗非鱼生长情况,结果表明低浓度不同形式硒都可有效地促进尼罗罗非鱼生长,但较高浓度下只有SeNPs可明显促进生长,相对安全性剂量范围大于其他两种硒形态。

4.4 富硒肥料开发

纳米硒在促进植物生长、生产富硒农副产品上也表现出良好的效应。在植物生长过程中,硒能够消除氧自由基,修复强光对叶绿素的破坏,增强叶片的光合作用[72],促进植物生长,并且增加果蔬含硒量。Domokos-Szabolcsy等[73]研究SeNPs和硒酸盐对烟草的生物的影响,结果表明SeNPs对烟草器官的分化有明显作用,可有效促进烟草根的生长。肖苏尧等[74]合成了淀粉硒纳米颗粒(St-Se0NP),并作为营养调节剂研究巨峰葡萄果实中硒含量的变化,结果表明在硒含量、糖份、钙含量、酸度方面,St-Se0NP均优于对照组,明显改善了葡萄的风味。SeNPs在植物方面的应用已受到重视,国家专利局已经授权果蔬类纳米硒营养调节剂及其制备方法[75],公开专利多糖复合纳米硒在富硒茶生产中的应用[76]。将SeNPs作为富硒肥料不仅有促于植物的生长[77],而且可用于生产富硒蔬果,对于改善果蔬品质具有重要意义。

4.5 环境污染治理

自然环境中存在的亚硒酸盐和硒酸盐都有较强的毒性,纳米硒转化菌可将其还原成安全性高、化学性质稳定的SeNPs,并且纳米硒可吸附环境中重金属离子形成金属氧化物-纳米硒复合物,以达到去除重金属污染目的。目前硒还原菌已成功应用于环境改善、净化污染等领域[78],如EnterococcuscloacaeSLD1a-1[79]已被运用于农业废水中硒氧阴离子亚硒酸盐和硒酸盐的生物降解;Shewanellaputrefaciens200[80]和Geobactsulfurreducens[81]合成的SeNPs能够结合环境中的HgO形成HgSe-NPs复合物,清除汞(Hg)的生物毒害作用。Jain等[82]研究发现,纳米硒可优先吸收清除造纸厂废水中铜离子,清除铜元素污染。

5 结语与展望

纳米硒是一种红色单质硒,具有低毒、高效的生理活性,粒径是影响纳米硒活性的重要因素。微生物转化合成的SeNPs与化学法和物理法相比具有显著优势,转化条件温和,SeNPs结构稳定、均匀,分散性好。并且微生物对纳米硒的转化具有普遍性,细菌、真菌、放线菌、原生动物均能转化合成SeNPs,在功能食品、药物、肥料、饲料、环境污染治理等方面具有重要的应用前景。

微生物转化纳米硒尽管展现出良好使用价值,但还面临诸多挑战,首先,筛选到转化能力强、适用于工业化生产的高产菌株是首先解决的关键问题,目前纳米硒的生产成本高是制约纳米硒广泛应用的因素之一,因此需要在进一步研究纳米硒合成机理、转化基因的基础上,利用现代化筛选方法、基因工程手段提高菌种转化纳米硒的能力,降低生产成本;其次,纳米硒的活性与其粒径大小有着密切的关系,微生物合成纳米硒受菌种、营养、培养条件等诸多因素影响,控制粒径是难点,也是未来研究的重要内容之一;第三,目前纳米硒被应用于农业和畜牧业上作为肥料和饲料添加剂使用,但在食品应用和药物治疗上还面临着挑战,SeNPs在体内的药物代谢动力学还不明确,尤其是对SeNPs在体内发挥生物效应的化学形式及作用机理还不清楚,未来研究需要跟踪SeNPs在体内的代谢过程,研究SeNPs在体内和细胞的相互作用,为SeNPs应用于食品医药奠定基础。