秸秆与猪粪混合高固厌氧消化产气性能及关键微生物分析

2020-08-17傅国志郭文阳马宗虎刘蔚李博凯孙子滟王祯欣李叶青

化工进展 2020年8期

傅国志，郭文阳，马宗虎，刘蔚，李博凯，孙子滟，王祯欣，李叶青

（1 中国华电科工集团有限公司，北京100160；2 河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；3 中国石油大学（北京）新能源与材料学院，生物燃气高值利用北京市重点实验室，北京102249）

我国作为农业大国，每年都有大量的农作物秸秆产出，秸秆是农业生物质资源的重要组成部分[1]，但秸秆的处理一直是关系到国计民生的问题。因为秸秆主要成分是木质素、纤维素之类的物质，这类物质在农田或其他自然环境中难以被降解，保留时间较长，占用土地空间并且影响农作物对营养物质的吸收。随着我国农业耕种技术的发展和作物产量的提升，2013 年我国农作物秸秆可收集量达到8.3 亿吨，2015 年达到9.0 亿吨[2]。近年来，国家对环保问题和生物质能源的重视程度提高，秸秆已经成为制备生物沼气的重要原料。但是随着秸秆沼气产业的不断深入，很多问题便开始突显出来。比如单一秸秆厌氧消化产气率低、进出料困难、运行的稳定性较差，这些问题导致投资多，效益低，严重制约秸秆沼气产业的发展[3-4]。

与此同时，伴随着人们生活水平的提高，对肉制品的需求日渐增加。畜禽养殖行业发展迅速，特别是规模化养殖场的比例持续升高，其产生的大量畜禽粪便也亟待有效地解决。利用厌氧消化技术，畜禽粪便可直接作为原料进行消化产沼气，消化效果优于秸秆的厌氧消化。单一原料的厌氧消化已经形成了成熟的技术，并且用在了现实的生活中[5]。但畜禽粪便中氮、磷含量较高，在消化后期氨氮含量肯定会大幅度上升，进而会对厌氧消化产甲烷过程产生抑制作用[6]。因此需要添加一种或多种其他有机物料与粪便混合，通过调节物料的配比，使原料的C/N处于合适的范围内，减少实验过程中大量的氨态氮释放和挥发性脂肪酸（volatile fatty acids,VFA）积累，提高厌氧消化的效率[7-8]。

目前有很多关于畜禽粪便与秸秆混合发酵的实验研究，证明了混合厌氧发酵可以提高沼气的产气率[9-12]。但是静置的厌氧干发酵过程，实验的启动期长，运行缓慢，产甲烷效率很低。因此，行业内的研究人员开始尝试改变干发酵运行状态，以提高产甲烷效率。研究表明，通过机械搅拌有助于猪粪和稻草的混合发酵原料与厌氧微生物之间有效接触，提高传质效果，从而改善厌氧干发酵的效率[13]。反应过程中，增加渗滤液回流，能使得鸡粪和秸秆混合发酵产甲烷量提高1倍以上[14]，并且回流喷淋的过程能调整发酵原料的含水率，增加原料中微生物的数量，加快原料分解和VFA 的产生[15]。相比于不回流的实验组，渗滤液回流能使发酵原料的总固体产气量提高29.17%[16]。综上所述，增设渗滤液回流装置可以提高干式厌氧发酵的产气效率。但前人研究的渗滤液喷淋回流多是集中在固定比例的混合原料进行实验，并且是全程持续性喷淋，对于大型的沼气发酵工程，消耗能量成本太高，并且原料的最佳配比不够明确。因此，本实验选用间歇性渗滤液喷淋装置，3种不同比例的混合原料（秸秆、猪粪）进行实验，旨在更加节能高效的前提下，探索得到使厌氧干发酵更加高效的混合原料配比，为沼气产业化的推广应用提供理论基础。

由于秸秆的总固体含量（total solid, TS）在90%以上，猪粪的TS 也在30%以上，两者的固含率都比较高，比较适合高固厌氧消化。因此本实验选择高固厌氧消化反应器（high-solid anaerobic digestion,HS-AD）。HS-AD是处理木质纤维素类原料和其他高固含率有机原料的有效方式[17-18]。研究发现，针对HS-AD 反应器原料流动性差、反应速率慢的问题，增加渗滤液回流装置可以有效地提高产气性能和稳定性[19]。相比于液相厌氧消化（liquid anaerobic digestion, L-AD），HS-AD 反应器的负荷大，节约用水量，产生的沼液量少，并且产甲烷性能依然较好[20]。

采用增设渗滤液回流的HS-AD装置，秸秆与猪粪混合进料的方法，设定3种（秸秆∶猪粪）混合比例，分别为R1（1∶1）、R2（2∶1）、R3（1∶2），进行干式厌氧消化实验。有研究表明，对于回流式HS-AD，设定前两周喷淋量是接种液的2 倍左右，第3周是1倍，最后不喷淋的条件，最终产气效果较好[21]。因此，考虑到节能增效的初衷，根据实验室实际的回流式高固厌氧消化反应装置，设定喷淋时间，即前两周4min/6h，第3周2min/6h，之后不喷淋。通过对比实验过程中液相性质的变化、微生物（细菌和古菌）群落的改变以及产甲烷的差异，分析原料配比对厌氧消化的影响，最终得到高固厌氧消化效果较好的混合原料配比。

1 实验材料和方法

1.1 实验装置

实验采用3个有机玻璃制成的车库式反应器作为反应器，有机玻璃厚10mm，反应器内径长400mm，宽300mm，高400mm，设计体积为48L，接种液罐为圆桶形，直径250mm，高200mm，设计体积10L。反应器和接种液罐由水浴保温，水浴层厚度为20mm，将水温控制在(37±0.5)℃，用热电偶检测各反应器和接种液罐的温度。接种液由循环泵吸入反应器喷淋回流，喷淋口对称分布于反应器顶部两处，采用定时系统进行接种液喷淋，可根据需求调节转子流量计控制喷淋量。厌氧反应器底部为一层高50mm 的方形不锈钢容器，再铺一层厚10mm、长宽为20～30mm 的小木块，以分离接种液和消化底物。如图1所示。

图1 车库式厌氧消化系统

1.2 原料和接种物

秸秆来自于河北石家庄，包括水稻秸秆和芦苇秸秆。猪粪来自河北石家庄某大型养殖场。实验所用的接种物是取自阿苏卫垃圾场（北京市昌平区）的垃圾渗滤液（又称沼液）。在5L玻璃瓶中倒入4L沼液，加入2g 葡萄糖（即0.5g/L），在恒温培养箱中37℃驯化3周，得到实验用的接种物。这几种物质的基本特性见表1。

1.3 实验设计

设定消化原料的总质量为1600g，将秸秆和猪粪按照质量比为1∶1、2∶1、1∶2 的比例称量，然后混合均匀，对应的反应器依次设为R1、R2、R3。各反应器中混合原料的性质如表2所示。接种液的量按1∶4（质量比）添加，即需要接种液6400mL。实验启动之前先将混合好的原料放入接种液中浸泡2h，使微生物与原料充分接触。之后，一并放入车库式厌氧消化反应器中，检测气密性，通5min N2保持厌氧环境，启动恒温循环水，接好集气袋，开始实验。其中，循环泵的喷淋流量为0.8L/min，实验启动之后的喷淋条件设定为：消化前两周，每隔6h 喷淋1 次，每次喷淋4min；第3周，每隔6h喷淋1次，每次喷淋2min；第4周，不喷淋。

表1 秸秆、猪粪和接种物的基本特性

表2 各反应器中混合原料的性质

1.4 样品测试和分析方法

TS 和VS 的测定是利用烘箱、马弗炉和天平，采用烘干及灼烧恒定法得到；采用实验室EA3000的元素分析仪（利曼中国，意大利）对秸秆、猪粪和接种物做元素分析；消化后样品中的单酸含量以及碱度（TIC）用配备有火焰离子化检测器和DBFFAP 柱的GC 色谱仪分析（安捷伦科技有限公司，美国）；产气量用湿式防腐气体流量计（长春汽车滤清器有限责任公司，中国）测定，气体的成分用GC9790Ⅱ型热导气相色谱仪（浙江福立分析仪器股份有限公司，中国）测得，每次取3 个样测定，取平均值。

沼液pH用赛多利斯pH计测得；微生物群落的具体方法是先使用DNA 提取试剂盒提取样品中的总DNA，通过ND-2000 分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定DNA的数量和质量[22]。然后，细菌以16S rRNA基因的V3～V4可变区序列为靶标，以带有barcode 序列的338F-806R 为引物[23]，同时古菌使用Arch344F-Arch915R 为引物进行PCR 扩增，得到PCR 产物。最终，PCR 产物经过定量及文库构建后，利用Illumina MiSeq PE300平台（Illumina公司，美国）进行高通量测序。

2 结果与讨论

2.1 甲烷含量

本实验以秸秆和猪粪作为原料，研究不同配比的秸秆和猪粪对厌氧消化的影响。实验进行了51天，期间各反应器产生的沼气中甲烷含量变化情况如图2所示。从实验启动的第3天开始取样，根据产气情况，每2～3 天检测一次甲烷含量。结果发现，实验开始之后，各反应器产生的沼气中甲烷含量都在不断上升，达到最大值之后逐渐趋于平稳。具体表现为：R1 反应器产生的沼气中甲烷含量从初始的14.7%逐渐增加到63.9%（第18 天），之后稳定在60.5%左右；R2从14.9%逐渐增加到66.2%（第25 天），之后稳定在60.7%左右；R3 从19.5%逐渐增加到64.2%（第25 天），最终稳定在61.3%左右。3组反应器产生的沼气中甲烷含量的大小以及变化趋势整体很相似，这说明秸秆和猪粪的不同配比对产生的沼气中甲烷含量的影响较小。

并且从图1中可以看出，产生的沼气中甲烷含量达到最大值之前，R3 反应器中产生的沼气甲烷含量均高于R1 和R2 反应器。由于R3 反应器添加的原始物料中猪粪量是秸秆量的2倍，很明显猪粪中的可溶性有机物相比于秸秆的可溶性有机物更容易转化为VFA，产甲烷的进程相对较快，这也导致了在实验进行的前期（前18 天），R3 反应器中生成沼气中的甲烷含量略高于其他两组反应。

2.2 累计甲烷产量和产甲烷速率

一般的厌氧消化反应器，接种比（原料与接种液的VS比）在大于4.0的情况下，实验的启动期都比较长，在20～30天，运行缓慢[24-25]。如果提高实验的接种比，整个厌氧反应的启动时间也会随之增加[26]。本实验R1、R2和R3反应器的接种比分别为7.78、8.99和6.58，均大于4.0，属于高含固厌氧消化体系，但是从图3 和图4 的实验结果中可以看出，3 组实验的启动期均大约为5 天，明显比传统的厌氧消化系统缩短了启动时间。说明反应器中增设的喷淋体系在一定程度上确实有助于加快反应的进行，提高了高含固厌氧消化的效率。随着实验的进行，沼气产量逐渐增加，根据沼气中甲烷的含量，换算得到产生的甲烷产量。经过51 天的厌氧消化之后，R1 累计产沼气82.51L，即单位VS产甲烷量为53.8mL/gVS。R2 累计产沼气229.66L，即单位VS 产甲烷量为131.8mL/gVS；同理得到R3单位VS 产甲烷量为122.9mL/gVS（如图3 所示）。另外，R2 和R3 实验组的产甲烷情况与宋香育等[27]的研究结果相一致，说明产气结果具有可靠性。R2 和R3 的累计产甲烷量高于R1 的产甲烷值。同时，对比甲烷的产生速率（如图4 所示），R1的最大产甲烷速率为3.4mL/(gVS·d)，R2和R3的最大产甲烷速率分别为6.8mL/(gVS·d)和8.3mL/(gVS·d)。因此无论是产甲烷量还是产甲烷速率，R2和R3的值都远高于R1。分析原因，可能是由于R1反应器的物料反应过程中微生物群落分布不均导致木质素、纤维素类物质的降解程度不同；或者是在实验启动之后有轻微漏气现象导致的。

图3 累计甲烷产量

图4 甲烷产生速率

2.3 液相性质的变化

为了更好地分析实验前期产气的差异，这里仅选取了实验启动后前28 天的液相样品，检测这段时间液相性质的变化以及后续的微生物群落丰富度和多样性。

2.3.1 挥发性脂肪酸（VFA）和pH

实验启动初期，原料中的易降解物质，比如纤维素、蛋白质、脂肪等，在微生物的作用下优先被分解为小分子酸，同时过程中伴有部分CO2和少量H2产生[28]。随着这些大分子有机物被体系中的微生物逐步降解，液相中的VFA浓度开始上升（如图5所示）。厌氧消化反应经历过水解、酸化过程（主要在10天以前），紧接着主要就是产甲烷阶段。在产甲烷的过程中，互营微生物之间或者是微生物与外界物质之间存在有电子转移的现象[29-30]。液相中的VFA，比如甲酸、乙酸等，在互营菌和产甲烷菌的作用下，甲酸可作为电子转移的载体，乙酸作为电子供体，转化为甲烷。从图5中可以看出，在第12 天，R1 和R2 液相中VFA 含量较高，分别为7129.5mg/L 和7945.3mg/L；在第9 天，R3 液相中VFA 含量为4042mg/L，远低于R1 和R2 中VFA 的含量。分析原因是由于R3（1∶2）混合原料中猪粪质量为秸秆的2 倍，整体总VS 的含量较少，导致水解后原料中最大VFA 含量并不高。在第10 天左右，3组实验的VFA含量都达到最高水平，液相对应的pH处于最低的状态，在7.0～7.7之间，如图6 所示。相比于其他两组，R2 的pH 是最小值7.0，推测是因为R2 实验组中秸秆含量较多，能跟酸反应的碱性物质相对较少。在第13 天之后，随着VFA 中的很大一部分单酸被产甲烷菌利用开始转化为甲烷，甲烷的产生速率达到最大，加上系统内部的自我调节，相应的液相pH 也开始缓慢上升最终至相对稳定的范围。第28天各组pH维持在8.3，实验结束后（第51天，图中未显示）测得3组沼液pH均在7.5左右。同样的，由于R3中猪粪含量多，体系偏碱性，pH始终在7.5以上。

由图5和图6可知，混合原料中VS含量越大的实验组（R1、R2），其在厌氧消化过程中的VFA浓度越高，但由于3组反应器中产甲烷的过程都是相同的，所以VFA 浓度的整体变化趋势是相同的。另外VS 含量较低的实验组（R3），在厌氧消化过程中pH的变化比较平缓。反应体系中的VFA与pH互相验证，能在一定程度上反映产甲烷能力。

图5 液相中VFA的变化

图6 液相中pH的变化

2.3.2 碳氮比和碱度

实验原料的碳氮比对于厌氧消化体系中的氨氮浓度和VFA 含量的变化起着至关重要的作用。有多种研究表明，碳氮比处于15～18的范围内时，整个厌氧实验进行地比较平稳，这与初始原料的性质和厌氧消化微生物的生长环境密切相关[31-32]。如果反应器中的碳氮比不合适，会造成反应过程中VFA 或者是氨氮浓度的大量增加，影响厌氧微生物，特别是产甲烷菌群的活性，严重时会导致实验以失败而告终[33]。本研究是中温下进行的实验，混合原料的碳氮比处于15～16之间，处于反应体系稳定运行的合适范围，能使厌氧微生物进行正常的生长代谢，很大程度上确保了系统的稳定性。

在厌氧消化的过程中，总碱度（total inorganic carbon,TIC）是衡量反应体系缓冲能力强弱的重要指标，是检测反应器能否平稳运行的重要参数，并且还可以估计液相中VFA浓度[34]。反应过程中主要依靠碱度中和酸性物质，维持pH 的稳定性，保持消化微生物的活性。如图7所示，从实验开始到第13 天，3 组实验TIC 的浓度均持续下降。在这个阶段VFA的浓度在不断增加，液相中的TIC因中和一部分VFA 被消耗，导致浓度大幅度降低。由于R2在实验过程中产生的VFA含量最高，对应的TIC浓度自然就最低，为3757.9mg/L。之后，随着产甲烷阶段VFA的消耗，TIC的浓度开始逐渐升高。在第28天，相比较R1和R2而言，R3的TIC浓度是最低的，仅比初始值提升了16.2%。与VFA浓度的变化趋势相反，VS 含量较低的实验组（R3），液相中TIC的变化幅度较小，趋势相对平缓，表明实验体系的缓冲能力相对较弱。R2 实验组液相中TIC 的变化幅度很大，造成这种结果的原因很可能是原始混合物料中VS含量的不同。

图7 液相中TIC的变化

2.4 微生物群落分析

厌氧消化实验启动之后，对3个反应器每周取一次沼液（循环的接种液），总计取4次，加上1份实验开始前的接种液，共13 份样品进行微生物分析。

2.4.1 细菌

从图8～10 中可以看出，随着反应的进行，在R1反应器中，梭菌科（Clostridiaceae）在实验启动前期大幅度降低（由23.53%降到最低8.21%），而后缓慢增加；紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）在实验启动之后增加很明显（由1.46%增加到最大22.4%），R2与R3反应器中此菌的变化情况均与此类似。假单胞菌科（Pseudomonadaceae）属于革兰氏阴性菌，表面极易生菌毛，能运动，多数具有分解蛋白质和脂肪的能力，是一种能广泛地利用有机化合物作为碳源和产生能量的电子供体。此菌科含量在实验开始后有部分增加，而后又逐渐降低。对比R2、R3反应器，可以发现假单胞菌在实验开始初期增加较大，随着实验的进行，后期含量较小。推测原因是R2 中的秸秆含量是猪粪的2 倍，秸秆中的纤维素类物质属于易降解成分，优先被微生物降解成小分子物质，之后转化为甲烷，剩余木质素成分难以被微生物降解利用[35]，小分子物质含量愈发减少，导致相对应的假单胞菌科含量开始下降；推测R3 中本身猪粪含量相对较多，也即初始阶段易降解成分较多，原料的利用率相对较高，所以产气量较大，然后在厌氧消化的后期，原料中易降解的成分剩余较少，可被利用的有机化合物含量不足，不利于假单胞菌的生长。另外，从图7 可知，细菌Caldicoprobacteraceae的含量变化特别明显（由0.9%增加到最大8.03%），它是一种嗜热蛋白质水解菌[36]，这可能与反应体系一直保持在37℃有很大关系，毕竟这样的中温环境有利于Caldicoprobacteraceae菌科的生长。从图9和图10中可以看出，R2和R3反应器的检测结果显示，此菌变化趋势与R1反应器中基本一致。特别是在R2反应器中，此细菌含量增幅最大（由0.9%增加到最大11.95%）。

图8 R1细菌群落的变化

图9 R2细菌群落的变化

图10 R3细菌群落的变化

2.4.2 古菌

首先，从图11～13 中很容易发现，3 个厌氧消化实验启动之后，除了甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae），古菌群落的含量相比于原始接种物中古菌的含量都有明显下降。原因可能是多数微生物在这个过程中需要时间去适应周边的生存环境。随着实验的进行，R1 反应器中甲烷微菌科（Methanomicrobiaceae）的含量明显降低，最终有小幅度的提升（由14.98%降到最低1.38%，后回升到10.32%）；在R2 与R3 反应器中，甲烷微菌科的变化趋势与此类似，并且更加显著。在厌氧消化实验进行的前后阶段，不管是R1、R2还是R3反应器，甲烷杆菌科（Methanobacteriaceae）的含量变化是最大的。因为甲烷杆菌是以甲烷为特异性代谢产物的细菌，是整个厌氧消化产甲烷过程顺利进行的关键细菌之一。从3个图中可以看到，在实验开展后，第3次取样的测试结果（R1-3、R2-3、R3-3）显示甲烷杆菌的含量有一定程度的下降，这也与那段时间产甲烷速率缓慢相对应。另外，R3 中甲烷杆菌科（Methanobacteriaceae）的含量在同阶段的3个反应器中是最大的。甲烷八叠球菌科（Methanosarcinaceae）的含量只有在第3、第4次取样的阶段，含量明显高于原始接种物，3个反应器变化情况类似。并且在前3 周，R2 反应器中的甲烷八叠球菌的含量比其他两组更有优势。这种菌是已知的可以作为种间直接电子传递（DIET）中电子受体的古菌，它的存在能够加快微生物群落间的电子传递效率，增加底物的降解速率[37]。所以推测原因是在此阶段，首先是易降解的成分大量被降解，之后剩余难降解的木质素等物质再缓慢的分解，依靠甲烷八叠球菌加快剩余成分的降解速率，导致最终原料的累计产甲烷量有所提高。甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae）是一种严格好氧的革兰氏阴性菌杆菌，专性甲基营养菌。所以在接种物加入反应器中之后，依靠秸秆空隙间的氧气，甲烷嗜甲基菌科（Methanomethylophilaceae）的含量开始增加，随着整个反应器中氧气含量降低，它逐渐减少甚至消失。图13也说明R3相比于R1和R2，较快地达到了完全厌氧的条件，这也与R3混合原料中秸秆含量最少有关。

图11 R1古菌群落的变化

图12 R2古菌群落的变化

图13 R3古菌群落的变化

2.4.3 微生物多样性分析

根据微生物群落分析的数据结果，得到的样品中物种多样性指数如表3所示。其中Chao指数反映的是微生物群落的丰富度，用来估计物种的总数。Shannon 指数反映的是群落的多样性。总体来看，细菌群落的丰富度和多样性都远高于古菌。相比于接种物，3个反应器中细菌群落的丰富度和多样性有不同趋势的波动。第2周、第3周取样的结果显示，R1 和R3 中微生物的丰富度和多样性都比较低，R2 中微生物的丰富度和多样性都高于其他两组。说明相比于R1和R3，R2依靠细菌群落的优势可以快速启动原料的水解过程，这或许也是其产气效果较好的一个原因。对于古菌群落，在取样的4周时间里，3组反应器中微生物群落的丰富度和多样性都是先不同程度的下降，之后有增加的趋势。对比发现，R2 反应器中整体的古菌群落丰富度和多样性处于较高的水平，并且变化比较平稳。这样的古菌群落变化过程有利于实验过程产气和体系平稳运行。