TRPC3基因多态性与原发性高血压患者左心室肥厚的关系

蒋永超，孙晓靖，陈玉岚△，张俊仕，珠勒皮亚司马义，徐新娟，张向阳

高血压可造成心、脑、肾、血管等靶器官损害，其中心脏靶器官损害以左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）最为常见。Framingham 心血管流行病学研究表明，LVH 是可独立预测心血管发病和死亡风险的指标［1］。研究证实，细胞内钙信号传递途径是诱导心肌细胞肥大发生、发展最重要的信号转导通路之一［2］。瞬时受体电位通道C 亚族（transient receptor potential-canonical channel，TRPC）是位于细胞膜上的一类重要阳离子通道，以四聚体形式构成Ca2+内流通道，TRPC3是TRPC家族中具有代表性且非常重要的一个亚群，是TRPC家族中的核心成员，在高血压心肌肥厚中起关键性作用［3］。目前有关高血压人群TRPC3基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与其LVH的相关性研究报道甚少。本研究以原发性高血压患者为研究对象，探讨TRPC3基因Rs2292232、Rs4995894、Rs4292355这 3 个位点 SNP 与 LVH 的关系，以期为高血压心脏靶器官损害的早期干预研究提供新的思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年3月—2017年12月于新疆医科大学第一附属医院高血压科住院并确诊为原发性高血压的患者305例，男205例，女100例，平均年龄（45.98±10.37）岁。根据左心室质量指数（left ventricular mass index，LVMI）将患者分为单纯高血压组224 例（对照组，LVMI 男＜115 g/m2、女＜95 g/m2）和高血压合并 LVH 组 81 例（LVH 组，LVMI 男≥115 g/m2、女≥95 g/m2）。纳入标准：（1）原发性高血压诊断符合《中国高血压防治指南2018 年修订版》。（2）年龄18～65岁。（3）均为汉族，且患者之间无一级、二级血缘关系。（4）患者知情同意本研究。排除标准：（1）明确诊断为继发性高血压者。（2）伴心脏瓣膜病、先天性心脏病、心肌病、严重心律失常等对心脏结构和功能有影响的心脏疾病者。（3）糖尿病、甲状腺功能亢进或减退等内分泌系统疾病者。（4）严重肝肾功能损害、慢性消耗性疾病和恶性肿瘤者。（5）血管紧张素转换酶抑制剂或者血管紧张素受体Ⅱ拮抗剂服用半年以上者。

1.2 方法

1.2.1 超声心动图测定 采用Philips iE33 彩色多普勒超声诊断仪进行检测，探头频率为5 MHz。由5 年以上心脏超声工作经验的技师完成。所有指标均连续检测3个心动周期取平均值，包括左心室舒张末内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室收缩末内径（left ventricular endsystolic dimension，LVESD）、室间隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）及 左 室 后 壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）等。按Devereux 校正公式计算左心室质量（LVM），LVM（g）=0.8×1.04×［（IVST+LVPWT+LVEDD）3-LVEDD3］+0.6，体表面积计算采用Stevenson 公式，即体表面积（m2）=0.006 1×身高（cm）+0.012 8×体质量（kg）-0.152 9，LVMI（g/m2）=LVM/体表面积。

1.2.2 DNA 提取 患者入院后次日清晨空腹取外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中密封，-70 ℃保存。统一采用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因组试剂盒（中国天根生化科技有限公司），按照说明书步骤提取基因组DNA，浓度＞0.02 g/L，光密度（OD）260/OD280比值1.8～2.0。

1.2.3TRPC3基因的SNPs 检测 采用Sequenom MassARRAY®SNP 检测结合多重PCR 技术、MassARRAYiPLEX 单碱基延伸技术及基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术（博奥生物集团有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中 心）对TRPC3基 因 SNP 位 点Rs2292232、Rs4995894、Rs4292355进行基因分型检测。各位点引物序列见表1。根据Hapmap、NCBI-SNP 数据库选择位点，按照最小等位基因频率（Miner Allele Frequency，MAF）＞0.05 且R2＞0.8 筛选出上述 3 个 SNP 位点。PCR 反应体系:10×PCR 反应缓冲液 0.5 μL、25 mmol/L MgCl20.4 μL、25 mmol/L dNTP 0.1 μL，二次蒸馏纯净水1.9 μL，500 nmol/L 引物混合物1.0 μL，5 U/μL Hot-StarTaq 0.1 μL，DNA模板1 μL。扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45个循环；72 ℃ 3 min，4 ℃保持。加入 SAP Mix 反应液 2.0 μL，SAP 处理条件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min，4 ℃维持。加入单碱基延伸反应液2 μL，单碱基延伸反应条件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，（52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s）×5，40个循环；72 ℃ 3 min，4 ℃维持，运用 MALDI-TOF 质谱仪分析树脂纯化后的扩增产物，检测结果采用TYPER4.0软件（sequenom）分型。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析与处理。Hardy-Weinberg 平衡定律验证样本的群体代表性。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，2 组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料用中位数和四分位数M（P25，P75）表示，2 组间比较采用Mann-WhitenyU检验。计数资料及组间基因型频率分布比较采用χ2检验，Logistic回归模型分析基因及相关因素与LVH 的关系，P＜0.05 为差异有统计学意义。

Tab.1 Primer sequence of PCR表1 PCR引物序列

2 结果

2.1 一般临床资料比较 2 组年龄、吸烟史、饮酒史、家族史、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、24 h平均舒张压（24 h DBP）差异无统计学意义（P＞0.05），LVH 组较对照组男性比例降低，24 h 平均收缩压（24 h SBP）、体质量指数（BMI）升高（P＜0.05），见表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验及等位基因分布频率比较 LVH 组、对照组TRPC3基因 3 个 SNP位点等位基因频率均处于Hardy-Weinberg遗传平衡状态（P＞0.05），样本具有群体代表性，见表3。2 组TRPC3基因 SNP 位点Rs4995894、Rs4292355基因型和等位基因频率差异均无统计学意义（P＞0.05）；Rs2292232位点基因型和等位基因频率差异均有统计学意义（P＜0.05），其中LVH 组较对照组TT 基因型频率明显升高（28.40%vs.15.63%，P＜0.05）。

Tab.2 Comparison of general clinical data between LVH group and control group表2 LVH组与对照组一般临床资料比较

Tab.3 Comparison of H-W genetic balance test and allele frequency between the two groups表3 LVH组与对照组Hardy-Weinberg遗传平衡检验和等位基因频率比较

2.3 Logistic 回归分析 以是否为LVH（否=0，是=1）为因变量，性别（女=0，男=1）、BMI、24 h SBP、Rs2292232基因型（GG+GT=0，TT=1）为自变量，进行Logistic 回归分析显示，女性、较高24 h SBP、TRPC3基因SNPRs2292232TT基因型为原发性高血压患者发生LVH的独立危险因素，见表4。

3 讨论

高血压合并LVH 是机体对血流动力学负荷长期增加的一种适应性反应，高血压和LVH均是心脑血管疾病的独立危险因素［4-5］。临床上，有些高血压患者虽然持久有效控制了血压，但心肌肥厚继续存在，部分高血压患者甚至在临床诊断高血压前就已经出现LVH。高血压伴LVH 的加权危险会加剧并促进心脑血管疾病的发生发展［6］，而逆转LVH 可显著降低心血管病死亡、心肌梗死、脑卒中和心力衰竭等发生的概率［7］。因此，高血压伴LVH 是一种需早期关注的靶器官损害。近年大量研究表明，心肌细胞内Ca2+浓度升高是引起心肌细胞肥大的最根本原因，是引起初级和次级应答基因变化的始动因素和载体，而且也是心肌肥厚发生、发展的关键［8］。TRPC通道是一种主要渗透Ca2+的非电压门控阳离子通道［9］，在心脏分布广泛，对心肌肥厚的发生起重要作用［10］；其机制可能是通过调控钙调节磷酸酶-活化 T 细胞因子（calcineurin-nuclear factor of activated T cells，CaN-NFAT）信号传导途径实现［11］。

TRPC通道有7 个亚型（TRPC1～TRPC7），其中人体TRPC2 是伪基因，不表达蛋白。TRPC3 参与心肌肥厚和心肌细胞凋亡2 个过程。Yamaguchi 等［12］发现，TRPC3 参与了体外小鼠心肌细胞应力诱导的Ca2+内流，而在TRPC3基因敲除小鼠中未见这种现象。Shan 等［13］研究表明，在成年小鼠心肌缺血再灌注损伤时，TRPC3的过表达能够引起心肌细胞凋亡但不参与心肌细胞的坏死。Ma等［14］研究表明，长期高盐饮食会导致心肌细胞线粒体TRPC3的高表达，增加心肌肥大标志物心钠肽、脑钠肽和β-肌球蛋白重链的表达，TRPC3的缺失能够拮抗高盐饮食诱导的心肌肥大。由此可见，抑制TRPC3将有望成为治疗心肌肥厚的潜在新靶点，TRPC3参与高血压合并LVH 的发生发展过程，但有关TRPC3基因SNP 多态性与高血压合并LVH之间的关系研究甚少。

本研究基线资料比较结果显示，女性、24 h SBP增高者及较高BMI更易发生LVH，Logistic 回归分析校正了多重混杂因素后发现，女性、较高24 h SBP是原发性高血压患者发生LVH 的危险因素。Gerdts等［15］研究也显示，女性高血压患者发生LVH的风险更高。同时本研究结果亦与Framingham 心脏研究结果［16-17］和亚洲高血压合并左心室肥厚诊治专家共识［6］中 展 示 的 结 果 相 近 。 2 组Rs4995894和Rs4292355位点在等位基因频率、基因型频率分布差异无统计学意义，Rs2292232位点基因型频率差异有统计学意义，故推测Rs2292232位点的变异可能是高血压合并LVH 的遗传易感因素。Logistic 回归分析显示，Rs2292232位点TT 基因型是原发性高血压患者发生LVH 的独立危险因素，提示TRPC3基因Rs2292232位点的基因多态性与高血压合并LVH存在较大关联。笔者推测TRPC3基因Rs2292232位点的基因多态性对高血压合并LVH 的影响的可能机制为：（1）TRPC3可能通过调节心肌细胞内Ca2+的浓度变化，使心肌细胞内Ca2+维持高水平状态，激活CaN-NFAT，造成多种心肌肥厚的相关基因表达，导致心肌细胞体积增大。（2）二酰基甘油通过TRPC3诱导的Ca2+信号通路参与了血管紧张素Ⅱ激活NFAT的过程，从而导致心肌肥厚。（3）TRPC3自身可能直接诱导心肌肥厚。（4）TT 基因型可能影响或改变心肌细胞TRPC3的活性及分布。

综上所述，TRPC3基因Rs2292232位点 SNP 与原发性高血压患者发生LVH 有关，其中TT 基因型、女性、较高24 h SBP 为原发性高血压患者发生LVH的独立危险因素。临床工作中需要对高血压高危人群开展易感基因的早期筛检，防控危险因素，使临床治疗趋于个体化，以减少靶器官损害、降低心血管风险。