一例猪繁殖与呼吸综合征病毒和盖塔病毒混合感染的诊断

次 仁，江朝源，朱 玲，3，徐志文，3

（1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.林芝市农业农村局，西藏 林芝 850400；3.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130）

盖塔病毒（Getah virus,GETV）是披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）成员[1]。1995 年Scherer等首次在马来西亚橡胶林中生存的白雪库蚊（Culex gelidus）中分离得到该病毒[2]。GETV可感染多种动物并引起马和猪发病。2017年湖南省暴发GETV猪群感染导致大量母猪流产和仔猪死亡，同年10月周峰等首次报道中国河南省某猪场的猪感染盖塔病毒[3]，这种病毒对10日龄内仔猪有致病性，其症状表现为引起仔猪发烧、荨麻样皮疹和后肢水肿并伴有关节炎，严重时导致死亡，同时也会造成成年母猪繁殖障碍[1]。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以造成成年母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸困难为主要特征的传染病，各种品种和年龄的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄的仔猪最易感，在临床上难以对两种病毒进行区分[4]。

本研究对中国四川省绵阳某猪场送检的流产胎儿和病死仔猪利用PCR和RT-PCR方法进行猪病毒性疫病的病原检测，诊断结果表明该例患病猪为猪盖塔病毒（GETV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的混合感染。

1 材料与方法

1.1 试验时间与地点

试验于2018年7月在四川农业大学动物生物技术中心进行。

1.2 材料

1.2.1 病料 病料来源于四川省绵阳某猪场送检的流产胎儿和病猪。

1.2.2 主要设备和试剂 RNAiso Plus来自宝日医生物技术（北京）有限公司；DL 2 000 DNA Marker、反转录酶试剂盒、2×Taq PCR Master-Mix、Nuceanse-Free water和pMD19-Tsimple载体，来自大连宝生物工程有限公司；Trizol LSReagent、小量质粒DNA提取试剂盒和小量胶回收试剂盒，于北京博迈德生物技术有限公司购买。大肠杆菌DH5α由四川农业大学动物生物技术中心制备。PCR仪、Gel DocTMEZ imager凝胶成像系统购自Bio-Rad公司，恒温水浴锅、恒温摇床购自Thermo Fisher公司。

1.2.3 检测引物的设计与合成 参考GenBank上GETV M1株全基因[7]（登录号为：EU015061），利用Primer Premiers 5.0软件针对Cap部分序列设计1对特异性引物[由生物工程（上海）公司合成]，蓝耳病采用实验室建立的高蓝和NADC30双重RT-PCR检测引物进行检测，具体信息见表1。

表1 试验中使用的引物信息

1.3 方法

1.3.1 病料样品处理 无菌采取送检病料的肺、大肠共约10 g，用PBS按1∶5稀释，研磨后反复冻融3次，保存到-20℃。

1.3.2 RNA提取 取300 μL研磨冻融后的病料液按照Trizol RNA提取试剂盒说明书提取病毒总RNA。反转录体系（10 μL）：ddH2O 4.5 μL、5×Buffer 2.0 μL、反转录酶 0.5 μL、dNTP 0.5 μL、随机引物0.5 μL、模板 2.0 μL。反应条件为：35 ℃ 5 s、85 ℃15 min，cDNA模板用于PCR扩增。

1.3.3 RT-PCR检测 PCR 体系（10 μL）：2×TaqPCR master Mix 5.0 μL、cDNA 1.0 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物0.5 μL、ddH2O 3.0 μL。反应扩增条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火30 s（退火温度见表1），72℃延伸 30 s，共35个循环，72 ℃延伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳并进行凝胶成像观察。1.3.4 流行特点和病理解剖变化 询问法了解猪场发病情况，常规剖解进行大体观察。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR诊断

电泳结果显示送检病料同时出现PRRSV 333 bp、GETV 316 bp左右的特异性条带，其余病原均呈阴性结果。由此说明该样品中同时含有PRRSV、GETV（图 1）。

2.2 流行特点及临床症状

四川省绵阳市某猪场共有妊娠母猪120头，仔猪约400头，送检流产胎儿为怀孕前、中、后期均有。患病仔猪初时出现采食量下降、被毛粗乱、皮肤苍白、精神沉郁等症状，怀孕母猪大量流产。随后猪只体温升高达40～41℃，食欲减少，咳嗽，急喘，耳朵及腹部下皮肤发绀，渐进性消瘦，最后呼吸困难，衰竭而死。

2.3 剖检病变

随机抽取1头发病活猪和1头病死仔猪进行剖检，剖检病变主要为肺呈橡皮样，肺脏出血且肺间质增宽，腹股沟淋巴结肿大出血，肾脏出现白色坏色斑，肠系膜淋巴结肿大，其他脏器无明显病变。

3 讨论

根据临床症状、剖检病变，结合实验室检测等综合判定，本次猪场发病猪主要是由蓝耳病病毒（NADC30株）和猪盖塔病毒引起的混合感染。

PRRSV作为能够引起呼吸和繁殖方面疾病的病毒，可通过呼吸道传播，猪的规模化养殖模式为PRRSV大规模暴发提供了潜在条件，疾病一旦暴发，传播迅速，导致大量仔猪死亡，会造成严重的经济损失。GETV属于人畜共患病病毒，近两年来中国开始报道分离到猪源的GETV，周峰等[3]于2017年报道分离到该病毒，并在山西、湖北、河南、安徽四省猪场中检测出37份阳性样本，同时在2017年湖南省猪群中发生了大规模GETV的感染，大量仔猪死亡，母猪流产导致了重大经济损失[5]，于2018年分离到第1株四川省猪源盖塔病毒[6]。两种病毒均能导致母猪流产，在临床上仅通过症状难以区分两种病毒，同时近年来病猪混合感染的比例不断攀升，其中PRRSV和PCV均属于免疫缺陷病，袁婧等在报道中指出，这两种免疫缺陷病与多种病原混合感染的现象十分普遍[7]，给疾病的防治工作带来了困难，多重PCR技术具有快速诊断、敏感度高的特点，将会在动物疫病的监控、诊断、防疫等方面发挥作用。

GETV作为新出现在人们视野中导致母猪流产的病毒，其与各个病原混合感染之间的机制尚不清楚，但在临床研究中开展流行病学调查和建立混合感染检测方法，并分析其流行病学特征十分有必要。