猪繁殖与呼吸综合征病毒湘潭分离株GP5基因的遗传进化分析

周 政

（湘潭市易俗河镇农技农机畜牧水产推广服务中心，湖南 湘潭 411228）

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS），又称为“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的一种具有高度传染性的疾病[1]。我国于1996年首次在母猪流产胎儿体内分离到该病毒，其后在我国多地区报道该病的发生与流行，但未对我国养猪业造成严重的经济损失[2]。2006年，我国江西地区大面积暴发以急性、高热、高发病率和死亡率为主要临床特点的高致病性蓝耳病（HP-PRRS），其后疫情在各地区广泛流行，给养殖行业带来巨大的经济损失。

PRRSV基因型可分为美洲型和欧洲型，GP5基因序列是变异率最高的基因之一，分析GP5基因变异情况可基本分析整个病毒基因组序列变异情况。本次研究对湘潭市某疑似感染PRRSV的猪场送检肺脏样品进行病原检测，通过RT-PCR法扩增并测定其GP5基因全序列，及进行遗传变异分析，旨在初步了解湘潭地区猪PRRSV流行毒株遗传变异规律，为相应的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集

2018年10月12日，笔者及团队于湖南湘潭市某养猪场采集2份疑似PRRSV感染的流产母猪的肺脏样品，病猪出现高热、呼吸困难和流产等临床症状，并最终死亡。

1.2 主要试剂

DNA/RNA extraction kit购自于美国Axygen公司，反转录试剂盒为天根生物公司产品；2×Taq PCR mix、DL 2 000 Marker和 Gel extraction kit等购自于TaKaRa公司；不同规格移液器购自于大龙兴创实验仪器（北京）有限公司。

1.3 引物合成与病毒检测

参考文献[3]合成扩增GP5基因序列全长的一对引物用于PRRSV的病原检测与分析，其扩增片段包括GP5基因序列全长，引物由长沙擎科生物科技有限公司合成。

取适量肺脏病变组织与灭菌PBS混合，高速匀浆后离心（12 000 r/min×10 min），取 200 μL 上清液用于病毒基因组（DNA/RNA）提取，操作流程按照说明书步骤进行。将基因组反转录获得cDNA。PCR反应体系（50 μL）：25 μL 2×Taq PCR mix，上下游引物各 2 μL，cDNA 模板 3 μL，灭菌水 18 μL；反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，37个循环；72℃7 min。PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，将阳性产物切胶后用Gel extraction kit回收DNA，进行双向测序。

1.4 序列分析与遗传进化分析

应用Clustal X 2.0软件对获得的测序结构进行拼接，下载GenBank收录的PRRSV参考毒株，利用DNAstar软件对序列进行比对，分别比较核苷酸和氨基酸序列的变异情况；应用MEGA 7.0软件中临接法对本次研究获得的PRRSV分离株GP5基因序列进行遗传进化分析。

2 结果

2.1 PRRSV病原检测结果

以提取的病料RNA所制备的cDNA为模板，应用RT-PCR法对两份病料中PRRSV病原进行检测，结果如图1所示，扩增基因片段全长大小约为1 600 bp，与预期结果一致，两份被检样品均显示为PRRSV阳性。

2.2 PRRSV GP基因序列同源性分析

利用DNAstar软件对测序的结果进行整理，并与GenBank收录的毒株序列进行核苷酸同源性比较，结果显示：本次研究获得的两株PRRSV分离株GP基因序列大小为603 bp，不存在核苷酸缺失或插入，以单个位点突变为主，其核苷酸同源性为99.7%，与HP-PRRSV分离株JXA1、CH-1a和TJ分离株同源性分别为99.0%～99.3%、94.2%～94.5%和99.0%～99.3%；与中国湖南省分离的毒株08HuN和Hunan-1核苷酸同源性较高，为99.0%～99.3%和99.2%～99.5%；与欧洲型 Lelystad virus（LV）分离株同源性为54.1%～54.7%；与美洲型经典疫苗株（MLV）和经典株（VR2332）同源性分别为86.1%～86.6%和86.1%～86.6%。

2.3 PRRSV GP基因序列遗传进化分析

应用MEGA 7.0软件绘制本次研究获得的两株PRRSV分离株（HuN-HH1和HuN-HH2）与GenBank收录的16株PRRSV分离株形成的遗传进化树，分析其遗传进化关系，初步确定其所属亚型。结果显示，本次研究获得的2株毒株与JXA1等HPPRRSV分离株聚为同一分支，且与湖南省分离的毒株（08HuN、Hunan-1）属于同一分支，亲缘关系较近；与经典毒株（MLV和VR2332等）和NADC30-Like毒株（NADC30等）所属分支均相隔较远，提示本次研究获得的两株PRRSV流行毒株均为高毒力毒株。

3 讨论

PRRSV在我国于1996年首次分离，其后该病在我国猪群中广泛流行与传播，目前PRRS是影响我国养猪业发展的主要传染病之一。PRRSV属于RNA病毒，具有毒株多样性和基因高变异率的特点。2006年，我国首次暴发HP-PRRSV，该病可导致患病猪群大规模死亡，造成相应的经济损失不可估量，其后我国也报道了DADC30-Like、QYYZ-Like等新发的变异毒株，使得有效防控PRRS发生与流行较为困难[4-5]。2018年7月初，湘潭市某猪场暴发疫病，通过临床诊断和病理解剖初步判断为PRRSV感染所引起，同时应用RT-PCR法对发病原因进行确诊，即为PRRSV阳性。

GP5基因是PRRSV主要的囊膜蛋白，同时也是具有高变异率的主要基因之一，通过监测GP5基因序列变异情况可大致了解PRRSV毒株变异情况。本次研究通过对两株PRRSV毒株的GP5基因序列进行扩增、测序与分析，结果显示，两株PRRSV毒株的GP5基因序列全长为603 bp，不存在碱基插入或缺失，只出现了单个碱基突变，两株毒株GP5基因核苷酸序列同源性为99.7%，与JXA1、TJ和08HuN等HP-PRRSV分离株核苷酸同源性为99.0%～99.5%，与美洲型经典疫苗株（MLV）和经典株（VR2332）同源性为 86.1%～86.6%，与欧洲型Lelystad virus（LV）分离株同源性为54.1%～54.7%；进一步遗传进化分析结果也显示本次研究的2株PRRSV流行株属于HP-PRRSV毒株。本次研究为该猪场乃至湘潭市PRRS的防控提供了依据。