丽江山慈菇药材鉴别方法改进

2020-08-14黄云先刘云怀杨光荣

云南中医中药杂志 2020年5期

黄云先　刘云怀　杨光荣

摘要：目的对丽江山慈菇标准中鉴别方法改进。方法用显微及专属性强的秋水仙碱对照品TLC薄层鉴别。结果显微鉴定作为鉴别中药、中成药的手段之一，其方法可变性不强、操作简便、而特异性较强，薄层鉴别引进代表性成份秋水仙碱对照品进行定性。结论改进方法简便、快捷，准确度高，专属性强，重现性好，可用于丽江山慈菇药材的鉴别及质量控制。

关键词：丽江山慈菇;TLC薄层色谱鉴别;秋水仙碱;显微鉴别

中图分类号：R284.1文献标志码：A文章编号：1007-2349（2020）04-0080-04

丽江山慈菇是百合科植物山慈菇Iphigenia indica Kunth的鳞茎[7]。又名山慈菇、土贝母、草贝母、假贝母、闹狗药[1]、苦子、光苦子、益辟坚[3]、光慈菇[5]。云南省地方习用药材，为纳西族、白族、彝族常用药材。载于《本草遗拾》，为《云南省药品标准》（1974年版、1996年版）、《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药收载品种。与《中国药典》（2015年版一部）收载“山慈菇”比较，来源系不同科属植物，为与国家标准相区别，谓之“丽江山慈菇”。是云南通用善美制药有限责任公司生产的“乳癖清胶囊（国药准字Z20025068）”的原料药之一。丽江山慈菇还是提制秋水仙碱的主要原料。《云南省中药材标准》2005年版第二册·彝族药中对丽江山慈菇的鉴别对照药材薄层色谱鉴别，本文参照文献[6]，通过对云南省丽江古城区和玉龙县及大理4个批次的丽江山慈菇样品做了显微鉴别及专属性较强的成分秋水仙碱的薄层色谱鉴别，以建立一个专属性更强的鉴别方法，从面达到控制丽江山慈菇药材质量的目的。

1仪器与实验材料

1.1仪器德国塞多利斯BT224S电子分析天平;梅特勒MS205DU电子分析天平;Purelab Flex 超纯水机。

1.2实验材料

1.2.1试药试剂秋水仙碱（C22H25NO6）对照品适量（中国食品药品检定研究院，批号：101176-201202，按93.6%计）;甲苯、丙酮、甲醇、三氯甲烷、环己烷（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）;水（实验室自制UP水，Ω=18.3）;硅胶GF254薄层板（青岛海洋化工）;硅胶G薄层板（青岛海洋化工）;硅胶G薄层板（美国莫克）。

1.2.2样品来源丽江山慈菇样品购买、采集丽江古城区、玉龙县及大理样品共4个。

L01，2015年8月，采自丽江市玉龙县龙蟠乡新文村;为野生品;为干燥花期全株。

L02，2015年9月，采自丽江市古城区金山乡东河村;为野生品;为干燥果期全株。

L03，2015年9月，购自丽江市古城区象山市场，为大理州鹤庆县野生品;为干燥药材球茎。

L04，2015年10月，购自丽江市玉龙县龙蟠乡新文村药农严四军，为其采挖的当地野生品;为干燥药材球茎。

2方法与结果

2.1显微鉴别本品球茎横切面：表皮细胞1列，细胞扁平，长30～60μm，厚18～23μm，外被角质层。其内侧为宽广的薄壁组织，薄壁组织中充满淀粉粒。维管束稀疏散在，外韧型，导管3～7个，环纹或网纹，导管常伴2～3个纤维。（自拟方法）（见图1）。

本品粉末类白色。淀粉粒众多，多为单粒，呈不规则球形、类圆形或盔帽形，直径4～35μm，少数为2～3复粒，脐点呈裂缝状或星状。导管环纹、螺纹或网纹，直径9～45μm（自拟方法），（见图2a-d）。

2.2薄层鉴别（原标准方法）取本品粉末2 g，加浓氨水1mL，三氯甲烷25mL，振摇，放置过夜，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷1mL使溶解，作为供试品溶液。另取丽江山慈菇对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部0502）試验，吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮-甲醇（6：3：1）为展开剂，另取氨水置展开缸中，预饱和15 min，展开，取出，晾干，置365 nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。再喷以改良碘化铋钾试液，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，（见图3）。

2.3薄层鉴别（自拟方法）本品粉末1 g，加50%甲醇20 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取丽江山慈菇对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。再取秋水仙碱对照品，加甲醇制成每1 mL含秋水仙碱0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015年版四部0502）试验，吸取上述3种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254 nm薄层板上，以三氯甲烷-环己烷-甲醇（10：2：1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视，样品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的萃灭斑点，（见图4）。

3分析方法验证

3.1薄层鉴别2.3中样品溶液制备试验筛选方法1：取本品粉末1 g，加甲醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法2：取本品粉末1 g，加乙醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法3：取本品粉末1 g，加50%甲醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法4：取本品粉末1 g，加50%乙醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法5：取本品粉末1 g，加70%甲醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

方法6：取本品粉末1 g，加70%乙醇20 mL，超声30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。

通过实验室实验，发现方法3操作可行性高，分离效果良好，方法验证效果良好，决定选用方法3为最终供试品制备方法。

3.2展开剂筛选展开剂1 三氯甲烷-丙酮-甲醇（6：3：1）

展开剂2：三氯甲烷-甲醇（10：1）

展开剂3：三氯甲烷-甲醇（10：3）

展开剂4：三氯甲烷-甲醇（19：1）

展开剂5：三氯甲烷-环己烷（10：1）

展开剂6：三氯甲烷-环己烷（10：3）

展开剂7：三氯甲烷-环己烷-甲醇（6：3：1）

展开剂8：三氯甲烷-环己烷-甲醇（10：1：1）

展开剂9：三氯甲烷-环己烷-甲醇（10：2：2）

展开剂10：三氯甲烷-环己烷-甲醇（10：2：1）

展开剂11：三氯甲烷-环己烷-甲醇（10：3：1）

通过比对用展开剂10号展开时RF值为0.37，在0.2～0.8药典规定的范围，展开效果好。

3.3檢视方法的选择（1）紫外光灯（254nm）下检视;（2）紫外光灯（365nm）下检视;（3）喷以改良碘化铋钾试液显色;（4）喷以饱和三氯化锑三氯甲烷溶液显色。选用上述了四种方法检视，第一法斑点清晰且方法简便。

3.4点样方式及点样量考察点样方式为接触点样;点样量为2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL。温度及相对湿度的影响按照试验所得薄层色谱条件，考察本品在温度5℃～30℃、相对湿度10%～75%展开时，对薄层色谱结果的影响。结果表明，在上述温度、湿度范围内对该薄层色谱结果无明显影响。

3.5预平衡试验按照试验所得薄层色谱条件，考察未平衡、平衡15 min、平衡30 min展开，对薄层色谱结果的影响。结果表明，平衡15 min比未平衡分离得好，平衡30 min展开时间太长。因此选用平衡15 min后展开。

3.6重复性不同产地的4批次样品的检测结果表明，该方法具有重复性。

4讨论

试验表明，采用方法3制备供试品溶液，硅胶GF254薄层板，点样量5 μL，以展开剂15 mL为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。所得薄层色谱斑点清晰，分离较好，易判断结果，且重现性好。

显微鉴定作为鉴别中药、中成药的手段之一，其方法可变性不强、操作简便、而特异性较强，可以说利用显微特征对比鉴定对大多数中药材都行之有效。经实验，丽江慈菇山也不例外，的确具有其显著的特异性。建议标准修订时增加显微鉴别。

原标准中鉴别项下未引进代表性对照品进行定性定量，考虑引进仙水仙碱作为其代表性成分。经实验，新拟方法薄层色谱条件可行。建议标准修订时增加现拟方法，应与秋水仙碱对照品及丽江山慈菇对照药材色谱相同。可见以秋水仙碱作为丽江山慈菇药材标识性成分有其合理性。可用于丽江山慈菇药材的质量控制。

参考文献：

[1]云南省药物研究所.云南天然药物图鉴[M].昆明：云南科技出版社，2004：225.

[2]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴[M].北京：科学出版社，1980：440.

[3]王国强.全国中草药汇编（卷二）[M].北京：人民卫生出版社，2014：543.

[4]中国药用植物志编委会编.中国药用植物志[M].北京：北京大学医学出版社，2014：106.

[5]有毒中草药大辞典编辑委员会.有毒中草药大辞典[M].天津：天津科技翻译出版公司，1991：265.