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正交试验优选清肺排毒合剂(新冠1号)制备工艺

2020-08-14黄锐杨思进蒲清荣罗群赵剑赖慧李静王饶琼任维

云南中医中药杂志 2020年5期
关键词:正交试验

黄锐 杨思进 蒲清荣 罗群 赵剑 赖慧 李静 王饶琼 任维

摘要:目的优选清肺排毒合剂制备工艺。方法以黄芩苷为检测指标,采用正交试验法优选清肺排毒合剂的水提工艺,并验证工艺的可靠性。结果最佳制备工艺是:12倍水浸泡0.5 h,提取2次,每次1 h;每剂收集芳香水40 mL,水提液减压浓缩至200 mL,20000 r/min离心2次。结论优选的水提离心工艺合理可行,稳定可靠,具可操作性和重复性。

关键词:清肺排毒合剂(新冠1号);黄芩苷;正交试验;芳香水;水提;离心

中图分类号:R965.1文献标志码:A文章编号:1007-2349(2020)04-0005-03

为了防控新型冠状病毒感染的肺炎疫情,2020年2月6日国家卫生健康委和国家中医药管理局联合发文推荐在中西医结合救治新型冠状病毒感染的肺炎中使用清肺排毒汤(国中医药办医政函〔2020〕22号)。清肺排毒方由汉代张仲景所著《伤寒杂病论》中的多个治疗由寒邪引起的外感热病的经典方剂优化组合而成,包括麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤和五苓散,组方合理,性味平和[1],含麻黄、桂枝、炙甘草等二十一味药,其功能为疏通三焦、清肺排毒、平喘止咳,可用于治疗新型冠状病毒感染的肺炎轻型、普通型、重型患者,在危重症患者救治中也可结合患者实际情况合理使用。为方便新型冠状病毒肺炎患者携带和使用,以及保证其质量,课题组将其开发成合剂—清肺排毒合剂,本试验以黄芩苷为检测指标,正交试验优选清肺排毒合剂的最佳制备工艺,为全国正在生产清肺排毒合剂的单位提供参考。

1仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪(LC-20AT泵、SPD20A检测器、CTO-10AS进样器、LcSolution色谱工作站);AUW120D电子天平(日本岛津);JA203H型电子天平(常州市幸运电子设备有限公司);HH数显电热恒温水浴箱(江苏国胜实验仪器厂);JP全数字超声波发生器(武汉嘉鹏电子有限公司);TU-1901紫外可见风光光度计(北京普析通用仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);101-2AB电热鼓风干燥箱(杭州汇110715-201308,供尔仪器服务有限公司)。黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号为含量测定用);麻黄、桂枝、炙甘草、杏仁等药材(购自泸州百草堂中药饮片有限公司,经西南医科大学附属中医医院蒲清荣主任中药师鉴定,均符合《中国药典》2015年版一部该药材项下规定);甲醇为色谱纯,水为纯化水,其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1水提工艺的正交设计采用正交试验法对清肺排毒合剂的水提取工艺进行优选。选取加水量、浸泡时间、提取时间、提取次数为考察因素,每个因素3水平,以黄芩苷的相对含量为评价指标,按L9(34)进行试验,正交因素水平见表1。

2.2含量测定

2.3.1黄芩苷色谱条件色谱柱:Inertsil ODS-SP C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2),流速1.0 mL·min-1,柱温40 ℃,检测波长280 nm,进样量10 μL,理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2500[2-3]。

2.3.2黄芩苷对照品溶液的制备精密称取对照品45.87 mg,用甲醇定容至50 mL棕色量瓶中,精密量取2 mL,置25 mL棕色量瓶中,加甲醇至刻度,得0.068 472 mg·mL-1溶液。

2.3.3供试品溶液的制备精密称取麻黄9 g,炙甘草6 g,杏仁9 g,生石膏30 g,桂枝9 g,泽泻9 g,猪苓9 g,白术9 g,茯苓15 g,柴胡16 g,黄芩6 g,姜半夏9 g,生姜9 g,紫菀9 g,冬花9 g,射干9 g,细辛6 g,山药12 g,枳实6 g,陈皮6 g,藿香9 g,分别按表1正交因素水平表进行试验,浸泡,水煎煮,过滤,浓缩,定容至250 mL容量瓶中,摇匀,精密量取2.5 mL置25 mL量瓶中,加水至刻度,摇匀,用0.45 μm微孔滤膜滤过,即得。

2.3.4标准曲线的绘制精密量取2.3.2项下对照品贮备液0.2 mL置25 mL量瓶中,分别吸取2 mL,4mL,6 mL,8 mL,10mL置10 mL量瓶中,分别用甲醇定容至相应刻度,摇匀,制得浓度分别为6.85,171.19,342.37,513.56,684.75,855.93 μg·mL-1的溶液,依次吸取10 μL注入液相色谱仪,测定。以峰面积(A)为纵坐标(Y),黄芩苷的浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),绘制标准曲线,得到回归方程:Y=32245X-288027,r2=0.9994(n=6)。

2.3.5精密度试验取2.3.4项下浓度为171.19 μg·mL-1对照品溶液10 μL,按2.3.1项下色谱条件测定,连续进样5次,测得黄芩苷平均峰面积5355031,RSD为1.60%。表明仪器精密度良好。

2.3.6稳定性试验取2.3.3项下制备的供试品溶液,分别于放置0,1.5,3,6,9,12 h各进样一次,每次10 μL,按2.3.1项下色譜条件测黄芩苷峰面积,RSD分别为1.45%,表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.7重复性试验取正交因素表1中正交试验提取液5号样品,按照2.3.3项下方法制备6份供试品,按2.3.1项下色谱条件测定峰面积计算黄芩苷成分含量,RSD分别为1.22%。表明试验重复性良好。

2.3.8回收率试验取9份已知含量的样品,分为3组,每组加入适量的黄芩苷对照品,按2.3.3项下制备9份供试品溶液,按2.3.1下色谱条件测定峰面积,计算平均加样回收率,结果黄芩苷收率分别为100.64%(RSD为1.18%)。表明此方法可行。

2.3.9专属性试验精密量取供试品溶液缺黄芩苷的阴性样品,按供试品制备方法制备,测定,结果表明黄芩苷其他组分对测定黄芩苷无干扰,本方法专属性强。

2.3.10耐用性取正交因素表1中正交试验提取液5号样品,按供试品制备方法制备,分别在色譜条件小的变动条件下:波长280±2nm,柱温40±5℃,测定黄芩苷含量,结果表明:波长、柱温小的变动时耐用性合适,满足系统适应性要求,本方法可靠。

2.3.11样品测定按2.3.1项下色谱条件,分别测定2.3.3项下供试品溶液中黄芩苷的含量,结果见图1。

2.4试验结果以及数据分析

2.4.1芳香水收集工艺研究清肺排毒合剂方中药材含较多挥发性成分,为了保留其挥发性成分,考察每剂收取芳香水的体积。按处方比例称取药材,加入10倍水,收集芳香水,每次10 mL,收集10次,稀释100倍后,用紫外可见分光光度计在200-400 nm光谱扫描。实验结果表明,前4次有较强的吸收,第5次吸收光度显著降低。故确定芳香水提取工艺为每剂收集40 mL芳香水。

2.4.2水提工艺采用正交试验优选清肺排毒合剂的水提工艺,按处方比例称取药材,进行正交因素表1的9组试验,按2.3.3水提供试品溶液制备样品,2.3.1项下色谱条件进行检测,以黄芩苷相对含量为指标,进行统计分析。结果见表2,表3。

由方差分析结果可知,D因素提取次数对于指标影响最大,经直观分析,其影响大小的顺序为提取次数>加水量>煎煮时间>浸泡时间,综合考虑,得最佳水提条件为A3B1C2D2,即加入12倍水,浸泡0.5 h,提取2次,每次1 h。

2.4.3水提工艺验证试验按处方比例称取药材,以最佳水提工艺条件,进行3次试验,测得黄芩苷的平均相对含量为53.57 mg·g-1,RSD为0.98%。优于正交9次试验,证明上述正交试验所得到的最佳水提工艺可行,重现性好。

2.4.4离心工艺研究为了除去不溶于水的杂质,减少有效成分的损失,便于患者服用,以及考虑实际生产,对其离心工艺进行了研究。以离心转速20000 r/min,进液流速为3 L/min,考察了离心次数对液体沉淀量的影响。离心1次,沉淀依然较多,而离心2次和3次沉淀明显减少,但相差不大,故从实际生产出发,选择离心2次。

3讨论

清肺排毒合剂处方来源于国家中医药管理局办公室、国家卫健委办公厅联合印发的《关于推荐在中西医结合救治新型冠状病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒汤”的通知》,前期临床观察疗效显著。但汤剂服用、携带不方便,也不利于及时抢救危重病人,易发霉、发酵、不能久贮等,结合清肺排毒方处方量大,芳香水多,将该方开发成合剂,每剂250 mL,保留了汤剂的优点,还方便新冠肺炎患者携带和服用,保证质量。

黄芩作为清肺排毒方中重要组成药味,具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症[4-5]。所含有效成分主要是黄酮及其苷类、萜类化合物及挥发油等成分[6-7]。黄芩的主要有效成分黄芩苷[8]具有抑菌、抗炎、降压、抗变态反应等药理作用,临床上可用于肺炎、脑缺血、肝炎、感染和肿瘤等疾病治疗。黄芩苷检测方便,稳定性好。故,选择黄芩苷作为优选清肺排毒合剂水提工艺的成分指标。

本试验选择离心工艺作为清肺排毒合剂澄清工艺的方式,未采用传统的水提醇沉。工艺中加入乙醇沉淀,时间长,生产成本增加,且灭菌后跟离心工艺处理的样品,沉淀量差不多,故采用离心工艺。

参考文献:

[1]国家卫生健康委员会办公厅,国家中医药管理局办公室.关于推荐在中西医结合救治新型冠状病毒感染的肺炎中使用“清肺排毒汤”的通知【国中医药办医政函〔2020〕22号】.[2020-02-06].

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2015:301.

[3]刘秋艳,金燕飞,段佩利.双指标综合评分法优化谷青通窍颗粒提取工艺[J].时珍国医国药,2019,30(11):2651-2653.

[4]崔岚,袁静,王平全.黄芩苷药理作用研究进展[J].中国医院药学杂志,2000,20(11):685-686.

[5]范淑红,罗夏.黄芩不同萃取物对痤疮致病菌抑菌及抗炎作用的影响[J].世界中西医结合杂志,2016,11(10):1361-1364.

[6]郑勇凤,王佳婧,傅超美,等.黄芩的化学成分与药理作用研究进展[J].中成药,2016,38(1):141-147.

[7]陈佩东,徐丹洋,李芳,等.UPLC-MS法分析黄芩炮制前后化学成分变化[J].中成药,2013,35(4):784-788.

[8]龙宇,向燕,谭裕君,等.黄芩苷药理作用及新剂型的研究进展[J].中草药,2019,50(24):6142-6148.

(收稿日期:2020-04-02)

基金项目:国家中医药管理局中医药防治新型冠状病毒肺炎应急研究专项课题(编号:2020ZYLCYJ02-3);西南医科大学-西南医科大学附属中医医院联合项目(编号:2020XYLH-003)

作者简介:黄锐(1986-),男,主管中药师,硕士,研究方向:中药新制剂研究。

通信作者:杨思进,E-mail:ysjimn@sina.com

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