防治新冠肺炎医疗机构制剂金香清瘟合剂的质量标准研究

袁建平 李玲瑞 杜瑶

摘要：目的 建立金香清瘟合剂的质量标准。方法 采用薄层色谱（TLC）法对制剂中的甘草、连翘进行鉴别;采用高效液相色谱法测定制剂中表儿茶素的含量。色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，流速为1.0 mL/min，检测波长为280nm，柱温为30℃。结果 甘草、连翘的TLC图斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。表儿茶素检测进样量线性范围为0.42μg～4.21μg（r=0.99996）;精密度、稳定性、重复性的RSD<1.0%，加样回收率为95.3%，RSD为1.0%（n=6）。结论 该方法操作简单、重复性好，可用于金香清瘟合剂的质量控制。

关键词：新冠肺炎;金香清瘟合剂;质量标准

【Abstract】Objective：To establish the quality standard of Jinxiang Qingwen Mixture. Methods：TLC was used to identify licorice and forsythia in the preparation and HPLC was used to determine the content of epicatechin in the preparation. The column was Agilent Eclipse Plus C18，the mobile phase was acetonitrile -0.1% phosphoric acid solution，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 280 nm，and the column temperature was 30℃. Results：The TLC images of licorice and forsythia had clear spots and good separation，and the negative control had no interference. The linear range of the injection volume of epicatechin detection was 0.42μg～4.21μg（r=0.99996），the RSD of precision，stability and repeatability was less than 1.0%，the recovery rate was 95.3%，and the RSD was 1.0%（n=6）. Conclusion：The method is simple and has a good reproducibility，and can be used for the quality control of Jinxiang Qingwen Mixture.

【Key words】new coronary pneumonia，Jinxiang Qingwen Mixture，quality standard

自2019年12月以来，湖北省武汉市出现大量新型冠状病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）的患者，且疫情急剧发展并快速蔓延至全国。截止2020年2月28日，全国已有78959人感染新冠病毒，死亡2791例。国家卫健委和中药管理局印发的《新型冠状动病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第五版）》明确指出NCP属于中医疫病范畴，具人传人的特点，以发热、乏力、干咳为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状[1]。从表里定病位，新冠肺炎病位在半表半里之间，大部分患者以发热为主，舌苔厚腻，口干口苦，脉数，这些都是热盛伤津证，留恋气分不解，病位主要在肺、脾、肝、膽，其病机是正虚邪实[2]。本院根据本地特点及其病机提出预防及治疗方—金香清瘟合剂，处方：金荞麦、蜘蛛香、金银花、连翘、芦根、淡竹叶、薄荷、荆芥、桔梗、广藿香、甘草，具有清热解毒、芳香辟秽、利湿湿瘟、清肺利咽的功效。目前该制剂已获得云南省医疗机构制剂应急审批医疗机构制剂注册批件。为更好控制金香清瘟合剂的质量，本研究参照文献[3-9]，对处方中君药金荞麦中表儿茶素含量进行测定，并对其中的甘草、连翘进行薄层色谱鉴别，从而保证金香清瘟合剂安全、有效、稳定，保障患者用药。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱仪;ME104万分之一电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;ME55十万分之一电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;TG16 g，高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

1.2 试剂 连翘甘对照品（批号：110821-210514，中国食品药品检定研究院）;连翘对照药材（批号：120908-201216，中国食品药品检定研究院）;甘草对照药材（批号：120904-201519，中国食品药品检定研究院）;表儿茶素（批号：110878-201703，含量以100.0%计，中国食品药品检定研究院）;乙腈为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）;磷酸（优级纯，西陇化工有限公司）;水为超纯水。金香清瘟合剂（批号：20200214、20200215、20200218，曲靖市第一人民医院制剂室）。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 甘草的薄层鉴别 取本品10 mL，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取甘草对照药材1 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷，滤过，滤液按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。取缺甘草的样品，按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照样品。照薄层色谱法（中国药典2015版通则0502）试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14：4：0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个或两个以上相同颜色的荧光斑点。

结果表明，供试品色谱中，与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰（见图1），可以作为该制剂的质量控制指标。

2.1.2 连翘的薄层鉴别 取本品20 mL，蒸至近干，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水30 mL洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取连翘对照药材1 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，同法制成对照药材溶液。再取连翘苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。取缺连翘的样品，按供试品溶液的制备方法制备成阴性对照样品。照薄层色谱法（中国药典2015版通则0502）试验。吸取供试品溶液及对照药材溶液各10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（9：1：0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

结果表明，供试品色谱中，与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性无干扰（见图2），可以作为该制剂的质量控制指标。

2.2 相对密度、pH检查 见表1。

2.3 表儿茶素含量测定

2.3.1 溶液的制备 对照品溶液的制备 取表儿茶素对照品10.56 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加乙腈-水（10：90）混合溶液溶解并定容，制成浓度为210.5664 ug·mL-1对照品储备液，备用。

供试品溶液的制备 精密量取本品5 mL，加于聚酰胺柱（30～60目，内径为1.0 cm，柱长为12 cm，湿法装柱）上，以水50 mL洗脱，弃去水液，再用乙醇150 mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩（50 ℃～70 ℃）至近干，残渣用乙腈-水（10：90）混合溶液溶解，转移至10 mL量瓶中，加乙腈-水（10：90）混合溶液稀释至刻度，摇匀，取续滤液，即得。

阴性样品溶液的制备 按照工艺制备缺金荞麦金香清瘟合剂样品，照供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.3.2 色谱条件及系统试验性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长为280nm;柱温为30℃。理论板数按表儿茶素峰计算应不低于3000。见表2。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取对照品储备液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、10.0 mL置10 mL量瓶中，用乙腈-水（10：90）混合溶液稀释并定容至刻度，得标准系列浓度，分别为 21.0566 ug/mL、42.1133 ug/mL、63.1699 ug/mL、84.2266 ug/mL、105.2832 ug/mL、210.5664 ug/mL。 吸取上述标准系列浓度各20 uL进样，按“2.3.2”色谱条件下进行测定，以表儿茶素的浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线，得到表儿茶素的回归方程为：Y=13 151.8X-316.775，r=0.999 96，在0.42 μg～4.21 μg范围内线性关系良好。见图3。

2.3.4 专属性 取缺金荞麦的金香清瘟合剂样品，同“2.3.1”项下方法处理，作为阴性样品，按“2.3.2”色谱条件下测定，结果显示，在与样品主峰保留时间处未出现相应的色谱峰。

2.3.5 精密度 精密吸取濃度为105.2832 ug/mL的表儿茶素对照品溶液20 uL，按“2.3.2”色谱条件下连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，结果峰面积的RSD%为0.089%，表明仪器的精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密量取金香清瘟合剂5 mL，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24h进行测定，记录表儿茶素的峰面积，结果峰面积的RSD%为0.77%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 精密量取金香清瘟合剂5 mL，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，平行操作6份，按“2.3.2”色谱条件测定，记录色谱峰的峰面积，结果峰面积的RSD%为0.35%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 回收率试验 精密量取金香清瘟合剂2.5 mL，共6份，每份分别加入对照品储备液1.0 mL、1.0 mL;2.0 mL、2.0 mL;3.0 mL、3.0 mL，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液。按“2.3.2”色谱条件，精密吸取上述6份供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，照“2.3.2”色谱条件测定，记录峰面积，外标法计算表儿茶素的平均加样回收率，平均回收率为95.3%，回收率良好，RSD为1.0%，符合分析方法的要求。见表3。

2.3.9 样品含量测定 取3批金香清瘟合剂，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液20μl，按上述色谱条件测定，记录色谱图，外标法计算各供试品溶液中表儿茶素的含量。见表4、图4。

3 讨论

新型冠状病毒感染的肺炎属风温夹湿，湿温者症状较重，此病机为湿邪入肺化热伤津扰及营血，治则应以除湿邪为主兼解热清营，本方采用银翘散加减，以金荞麦为君药具有清热解毒、清肺排痰的功效[10]。马蹄香、藿香为臣药，芳香化湿辟秽，降低方药的秽重之味，加重健脾利湿之功[11，12];金银花、芦根有抗上呼吸道及肺部感染的功用，马蹄香、金银花具有抗病毒作用[13]。芦根、竹叶清热生津，合金银花、连翘具有透热转气的作用[14，15];薄荷合金荞麦、桔梗增强清肺止咳、润肺化痰、利气宽胸宣散风热、清利咽喉的功效，三者同为佐助药，甘草调和诸药，适用于舌质偏红，苔薄白少津及薄黄者的预防和治疗。

金香清瘟合剂有金荞麦、蜘蛛香和其他药材经水提醇沉制成，所含成分较多，以君药金荞麦中表儿茶素含量为质控指标，摸索质控条件，并建立了金香清瘟合剂中表儿茶素的含量测定方法。在药材前处理过程中，用乙腈-水（10：90）和用70%乙醇作溶剂，考察加热回流20min和超声20min，两种提取方法结果均不理想，杂质太大;后采用乙腈-水（10：90）超声处理30min，再经聚酰胺柱（30～60目，内径为1.0cm，柱长为12cm，湿法装柱），以水50 mL洗脱，弃去水液，再用乙醇150 mL洗脱和直接取样品按上述方法洗脱，结果差别不大，最终确定为直接取样品进行洗脱。含量测定过程中，曾用流动相甲醇-0.004%磷酸（10：90和乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱，检测波长均为280nm，流速1.0 mL·min-1，柱温30℃，结果表明，以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱的表儿茶素峰与杂质峰分离度较好，达到基线分离，且柱效高。本文建立了金香清瘟合剂中的2个薄层鉴别和1个含量测定项，结果表明，本方法简便易操作，结果准确，重复性和专属性较好，大大提高了药品的质量可控性，以上研究可为金香清瘟合剂开发为安全、有效与可控的临床制剂提供科学数据支持。

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