白细胞介素-6启动子区rs200852701(G/A)与南通地区汉族人群脓毒症发病关系的研究

刘亚军 王智兰 全超

【摘要】 目的 探讨江苏南通地区汉族人群中白细胞介素-6（IL-6）基因3′UTR的rs200852701（G/A）多态位点单核苷酸多态性（SNP）与脓毒症发病之间的关系。方法 51例脓毒症患者作为实验组， 领选择52例同期门诊行健康体检患者作为对照组。分别提取实验组和对照组基因组DNA， 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术扩增目的基因片段并测序。分析IL-6基因启动子区rs200852701（G/A）与脓毒症发病之间的关系。结果 对本实验的IL-6基因聚合酶链式反应（PCR）产物， 进行相关基因分型， 结果显示， 研究对象中IL-6的SNP分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。测序结果表明IL-6基因存在SNP位点rs200852701（G/A）。实验组的血浆IL-6水平为（14.23±6.1）pg/ml， 高于对照组的（11.07±3.81）pg/ml， 差异有统计学意义（P<0.05）。结论 IL-6基因3′UTR的靶位点rs200852701（G/A）多态位点SNP与脓毒症发病之间存在一定关系。

【关键词】 脓毒症;白细胞介素6;单核苷酸多态性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.20.086

【Abstract】 Objective   To discuss the correlation between single nucleotide polymorphism （SNP） of interleukin-6 （IL-6） gene 3 'UTR rs200852701 （G/A） and sepsis in Han population in Nantong， Jiangsu province. Methods   There was 51 sepsis patients as the experimental group， and concurrent 52 healthy examinee as the control group. Genomic DNA was extracted from sepsis group and control group， and polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） technology was used to amplify and sequence the target gene. The correlation between IL-6 gene promoter rs200852701 （G/A） and sepsis was analyzed. Results   The IL-6 gene polymerase chain reaction （PCR） product of this experiment was subjected to related genotyping. The results showed that the distribution of SNP of IL-6 in the study subjects was in line with Hardy-Weinberg genetic balance. Sequencing results showed that there was a SNP site rs200852701 （G/A） in the IL-6 gene. The plasma IL-6 of the experimental group was （14.23±6.1） pg/ml， which was higher than that of the control group （11.07±3.81） pg/ml， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion   IL-6 gene 3′UTR rs200852701 （G/A） polymorphism site is associated with sepsis.

【Key words】 Sepsis; Interleukin-6; Single nucleotide polymorphism

膿毒症是因感染导致的系统性炎症反应， 可以导致多器官功能衰竭和死亡。也是目前医院患者死亡率和医疗资源消耗的主要严重疾病之一。在美国， 严重脓毒症占重症监护室（ICU）患者发病率的10.00%， 致死率可高达50.00%[1]。而德国2013年有280000例住院患者被诊断为脓毒症， 其中7500例患者死亡[2]。近年来， 控制脓毒症的发病率和死亡率一直是各国重点研究的领域之一。随着认识的深入， 目前脓毒症的发病率和死亡率较以往都有了一定程度下降[3]。IL-6是参与系统炎症反应的促炎细胞因子之一。先天性和获得性免疫反应中起着重要作用。它促进炎症现象， 比如刺激淋巴细胞的增殖， 促进B细胞的分化， 是一种最重要的炎症急性期的反应介质[4]。IL-6由多种类型的免疫细胞产生， 包括激活巨噬细胞、单核细胞和淋巴细胞。据报道[5]， IL-6的基因多态性与多种疾病的发病与预后密切相关， 国外研究表明[6]IL-6的基因多态性对预测烧伤患者的重症感染发病率， 脓毒症患者的预后有着重要作用。目前， 国内对于脓毒症与基因多态性相关文献报道较为匮乏。单核苷酸多态性多探索是评估和鉴定某种疾病遗传倾向的关键方法， 本研究采取经典聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性的分析方法， 分析南通地区汉族脓毒症患病人群中IL-6基因rs200852701（A/G）多态性的分布， 并分析其与疾病预后程度的关系。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2017年3月～2019年3月入住南京中医药大学南通附属医院（南通市中医院）重症医学科的51例脓毒症患者作为实验组， 其中男26例， 女25例;平均年龄（55.53±16.23）岁;肺部感染所致脓毒症30例， 腹部感染所致脓毒症17例， 尿路感染所致脓毒症4例。纳入标准：①符合脓毒症的诊断标准;②符合2012年国际脓毒症制定诊断标准及最新sepsis3.0的诊断标准;③年龄>18岁。排除标准：①年龄<18岁或>80岁;②无或不愿接受中心静脉置管的患者， 或有置管禁忌患者;③行急诊手术患者;④心脏停搏患者。领选择52例同期门诊行健康体检患者作为对照组， 其中男31例， 女21例;年龄（54.11±6.06）岁;纳入标准：全部对照组人群临床及实验室检查指标均在正常范围之内， 排除相关患有肾病、肝病、内分泌系统和心脑血管疾病者。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。本实验研究经医院伦理委员会批准， 所参与对象及其家属均已对本研究内容及目的知情予以充分告知， 并表示自愿参与。

1. 2 方法

1. 2. 1 外周血DNA的提取方法 全部采用离心柱[BloodgenomicDNA Minikit（0.1～1.0 ml）]提取所入选受试对象的外周静脉血DNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度计数仪器进行OD值的检测， 方法：1.25%琼脂。电泳缓冲液（0.5XTBE）SYBREGold染色液6X凝脂载样缓冲液糖凝胶电泳检测， DNA均质检合格， 转移至96孔板， -20℃储存备用。

1. 2. 2 引物的设计与合成根据SNP位点序列信息 使用Sequenom公司的引物设计软件Assay design设计PCR和单碱基扩展引物， 并交由上海生工公司合成。上游引物：5'-AGATGCAATAACCACCCCTG-3， 下游引物：5'-GATCTGGCTCTGAAACAAAGG-3'。

1. 2. 3 PCR扩增反应PCR反应体系 4 μl PCR master mix， 1 μl模板DNA（20 ng/μl）。PCR循环程序：94℃预变性5 min;94℃变性20 s， 56℃退火30 s， 72℃延伸1 min， 重复45个循环;72℃延伸3 min， 产物4℃冰箱保存， 备用。PCR反应产物送至上海生工公司测序， 测序结果使用Sequercher进行基因分析。

1. 3 两组血浆IL-6检测 实验组入院24 h内使用采血管收集5 ml外周静脉血， 对照组使用同品牌采血管收集清晨空腹外周静脉血5 ml。等待自然凝固后， 放入离心机（型号Sorvall? Legend? Micro 17）， 离心结束后取上清， 至-70℃冰箱（海尔DW-50W255）保存， 备用。采用ELISA（AbcamSimpleStep试剂盒）法检测两组IL-6， 全部相关操作均严格按标准使用说明书步骤进行。

1. 4 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件处理数据。HaploView4.0软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验， 两组间的基因型及等位基因型频率比较采用χ2检验或按照Fishers确切概率法， 计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用方差分析检验计量资料的显著性， 方差不齐时采用对数转换或采用非参数的秩和检验。95%的可信区间（95%CI）和比值比（OR）表示相对风险度， 用于分析脓毒症的发病风险。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 当患者外周血提取的基因组DNA的浓度跨度为326～460 ng/ml时， 实验组与对照组的360/480值均在1.8左右， 表明提取的基因组DNA的质量相对可靠， 可考虑用于本次实验所需PCR扩增。图1显示IL-6第5个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果。产物大小为390 bp， 与设计引物对应的IL-6基因相同。没有观察到明显的非特异性条带， 这与理论预测一致。

2. 2 PCR产物测序结果 对来自103例研究对象的DNA样品进行正向和反向测序后所获得的测序结果， 测序成功率在99%以上。见图2。两组外周血IL-6基因rs867186（G/A）位点基因型和等位基因的结果见表1。

2. 3 测序结果的比较 将本次测序结果与美国国家生物信息中心（NCBI）数据库中获得的IL-6基因的序列进行对比， IL-6基因的PCR产物与美国国家生物技术信息中心（NCBI）中查询所获得的IL-6序列， 测序结果是几乎是相同的， 序列同源性可达99.5%。见图3。

2. 4 IL-6基因的SNP分析结果 对本实验的IL-6基因PCR产物， 进行相关基因分型， 并予Hardy-Weinberg遗传平衡试验以评估群体代表性。结果显示， 研究对象中IL-6的SNP分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡。测序结果表明IL-6基因存在SNP位点rs200852701（G/A）。见图3。

2. 5 两组血浆IL-6水平比较 实验组的血浆IL-6水平为（14.23±6.1）pg/ml， 高于对照组的（11.07±3.81）pg/ml， 差异有统计学意义（P<0.05）。见图4。

3 讨论

脓毒症给社会及医疗带来了巨大的经济负担。目前研究表明， 脓毒症是感染为诱因， 从而引起的机体失控的炎症反应所致， 其反应与个体基因表现型有一定的相关性[7]， 目前， 基因多态性与感染及脓毒症的关系正成为临床工作者关注的方向目标。

既往众多相关研究表明， IL-6的基因多态性与感染、消化系统疾病、急性呼吸衰竭等多种疾病的发生发展有着密切的相关性[8]。目前研究主要关注于IL-6的多态性与脓毒症感染和丙型肝炎的关系， 已报道的IL-6的SNP位点包括（-174 G>C， -572 G>C和-597 G>A）[9-11]。在一项意大利的研究中发现[12]， IL-6启动子端的-597与-174SNP位点在慢性丙肝患者和健康人群中存在显著差异。在一项关于脓毒症的研究中， IL-6的启动子的-174SNP， 野生型G等位基因具有更低的器官衰竭可能性。也有研究表明[13]， 在1227例CAP的患者中， 那些携带GG基因型的患者具有更低的急性呼吸窘迫综合征发病率。通过严格控制和双盲试验， 本研究發现， IL-6多态性rs200852701与南通地区汉族人群的脓毒症发病率相关。提示IL-6多态性rs200852701是脓毒症的遗传易感性所存在的相关因素。本研究结果亦表明， 实验组rs200852701位点AA基因型频率高于对照组， 提示AA基因型提高脓毒症的发病率。

本研究發现在脓毒症患者中， IL-6的水平显著增高， 本次实验发现IL-6 rs200852701（G>A）上存在新的SNP位点影响IL-6在脓毒症患者中的表达， 故推断IL-6转录因子基因多态性rs200852701与南通地区汉族人群的脓毒症发病率相关。综合实验数据， 本次实验所发现的IL-6基因的多态性可能是脓毒症的一种新的遗传易感性因素。

本研究仍然存在一定的相关局限性。首先， 由于时间限制， 本次研究收集南通地区汉族人群脓毒症患者数较少， 仅为103例。故进一步的研究考虑需要扩大时间跨度， 收集更大的队列和相关随机对象， 应考虑进行多中心双盲研究， 以便进一步探究rs200852701位点多态性与脓毒症之间存在的相关性及影响机制， 其次， 由于本次实验规模较小， 未能够比较不同感染部位导致的脓毒症。增加各部位不同感染类型、完善细菌培养的相关检查数据可能会为进一步研究关于IL-6多态性与脓毒症发生和发展所存在的关系提供有力证据。

综上所述， 本研究结果表明IL-6多态性rs200852701与脓毒症有一定相关性。仍需深入探讨两者之间的关系及影响机制， 从而可能会对脓毒症的早期发现、治疗提供更好的治疗方案， 提高脓毒症患者的预后及改善今后的生活质量。

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[收稿日期：2020-03-19]