颈项透明层联合母血游离胎儿DNA在高龄单胎非整倍体中的应用

翟敬芳 吴杰斌 张蓓 沙静 张晶波

(徐州医科大学徐州临床学院、徐州市中心医院 产前诊断中心，江苏 徐州 221004)

胎儿颈项透明层(nuchal translucency，NT)作为超声一项软指标，可用来筛查胎儿染色体异常[1-3]，新一代高通量测序技术(next generation sequencing ，NGS)对母血中游离胎儿DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)进行无创产前检测(noninvasive prenatal testing，NIPT)得出胎儿13、18及21号染色体三体的风险率，其在高危孕妇胎儿非整倍体中的筛查价值日益得到临床工作者的认可[4，5]，但国家卫生健康委员会发布的NIPT技术规范([2016]45号文件)中规定高龄孕妇(预产年龄≥35岁)胎儿染色体检查仍在产前诊断之列，但有创性产前诊断需要投入更多的人力、物力，如何应对近年二孩政策下的高龄单胎孕妇胎儿染色体非整倍体筛查和诊断，成为各地产前诊断中心致力此类人群的研究方向。本院自2015年7月至2018年6月采用NT联合NIPT在高龄单胎孕妇胎儿染色体非整倍体筛查中的应用进行总结如下。

1 资料与方法

1.1 基本资料 追踪2015年7月至2018年6月徐州市中心医院产前诊断中心接受NT检查并具有完整资料的1525例高龄单胎孕妇作为研究对象，年龄35～45岁，因一部分孕妇要求NIPT，在入组前排除了自身恶性肿瘤、染色体异常、干细胞移植手术史，根据NT>第95%百分位或≥3.0mm，分为NT异常组36例和NT正常组1489例，NT异常组均接受产前诊断；两组年龄及孕周均无统计学差异(P>0.05)。NT正常组有1161例接受NIPT为无创组，其余328例接受有创产前诊断为有创组(302例行羊水穿刺检查，26例行脐血检查)，NT异常组中有2例绒毛活检染色体检查结果正常(后续于孕18周进行了羊水穿刺检查胎儿核型正常)，32例行羊水穿刺检查，2例行脐血穿刺检查，所有孕妇均接受超声检查，对其临床资料及妊娠结局进行统计分析。所有的孕妇均充分知情告知并签署知情同意书。本研究已经过医院医学伦理委员会批准(批号：XZXY-LJ-20161121-012)。

1.2 超声检查 应用GE Voluson E8彩色多普勒超声诊断仪，采用凸阵探头，探头频率3. 0～5.0MHz。按照国际妇产科超声学会颁布的早孕期胎儿超声指南[6]， NT在妊娠11～13+6周且胎儿顶臀径45～84mm时进行，并按照标准切面要求，由接受规范培训的超声医师对胎儿颈部皮肤与软组织间半透明组织间的最大厚度值重复测量3 次，取最大值为NT值，同时进行早孕期系统结构彩超的检查。妊娠11～13+6周NT>第95%百分位或≥3.0mm为异常。对所有胎儿行染色体检测时同步进行18～24周胎儿系统彩超检查。

1.3 母血cffDNA NIPT 充分知情告知，对NT正常自愿行NIPT检查的孕妇于孕13～22+6周内抽取10ml外周血EDTA抗凝,进行分离血浆、抽提DNA、制备测序文库，采用Proton进行测序，将每个样本测序的序列与人类参考基因组进行比对，最终得出胎儿患染色体非整倍性风险。

1.4 染色体核型检查及分子遗传学分析 对NIPT高风险及NT异常的孕妇进行遗传咨询,知情同意后进行羊水穿刺(16～23周)或脐血穿刺(23～28周)进行胎儿细胞培养、收获并经G显带染色体核型分析。在实验过程中为了留取胎儿细胞以便后续分子检测， 6～7天后含细胞的羊水悬液继续培养后冻存，多培养一瓶脐血细胞予以冻存，对于NT异常要求分子遗传学检查的孕妇知情同意后进行染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)。

1.5 随访 所有孕妇进一步跟踪胎儿系统超声结果，随访至胎儿出生，并由儿科医生对所有新生儿进行常规的体格检查。

1.6 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计数资料用数值(率)表示，组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率，计量资料经正态性分布验证后两组间采用两独立样本的t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NT正常组与异常组胎儿染色体非整倍体的比较 NT正常组中确诊胎儿非整倍体3例(无创组1例、有创组2例)，而NT异常组确诊7例。无创组NIPT筛查出非整倍体3例(21-三体高风险1例，45，XO 1例，47，XXX 1例)，确诊1例21-三体胎儿，其余为假阳性，NIPT对常染色体阳性预测率为100%，性染色体阳性预测率为0%。NT异常组中7例胎儿染色体非整体是：3例21-三体、2例18-三体及47，XYY和45,XO 各1例 ，NT正常组胎儿非整倍体确诊率0.20%(3/1489) 明显低于NT异常组19.44%(7/36)，差异均具有统计学意义(P<0.05)，详见表1。NT异常组中12例羊水核型检查同时进行羊水细胞CMA结果示：与羊水培养核型结果一致，其中2例47,XN,+21，1例47,XYY，余9例正常。

2.2 NT正常组与异常组胎儿超声结构上的比较NT正常组超提示胎儿结构异常40例，异常组14例有超声结构改变，两组胎儿非整倍体及超声结构改变比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)，详见表1。NT正常无创组中1例21-三体超声提示胎儿有鼻骨缺失改变，2例核型正常胎儿无超声结构改变；NT正常有创组中1例18-三体胎儿系法洛四联症，另1例21-三体无超声结构上改变。

表1 NT正常组与异常组胎儿非整倍体与超声异常例数比较(例)

2.2 10例确诊非整倍体胎儿超声结构表现 仅1例21-三体胎儿无超声结构改变外，9例均在中孕期18～24周胎儿结构彩超检查时发现胎儿异常，临床资料见表2，同时发现7例NT异常同时染色体异常胎儿有3例合并先天性心脏病，构成比为42.9%(3/7)。

表2 10例胎儿非整倍体临床资料

2.3 超声结构改变的胎儿染色体非整倍体确诊率在NT正常组与异常组间的比较 NT正常组40例超声异常，胎儿非整倍体例数前者2例，而NT异常组超声异常14例，胎儿非整倍体例数7例，超声结构改变的胎儿NT正常组与异常组相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

表3 正常组与异常组胎儿超声结构异常染色体非整倍体比较(例)

2.4 随访结局 共有23例引产，其中9例胎儿染色体非整倍体引产(8例胎儿超声异常)，14例胎儿超声异常但NIPT提示胎儿非整倍体低风险或胎儿核型正常引产，包括复杂先天性心脏病6例、重度脑积水3例、严重水肿3例、膈疝2例，1493例足月分娩，8例早产，另1例在孕22周胎膜早破流产。新生儿随访未发现染色体非整倍体病例。

3 讨论

胎儿染色体疾病主要表现为数目异常，如21、18、13及性染色体数目异常，Syngelaki等[7]基于对14 684例绒毛活检染色体核型分析显示2030 例(13.8%)染色体核型异常大多数为三体型，其中79.2%为21-三体、18-三体或13-三体，8.4%为性染色体异常。高龄孕妇胎儿染色体异常以染色体数目异常为主，其中21-三体发生率最高[8]，我们对高龄单胎孕妇人群染色体和CMA分析临床研究结果与此一致，相关研究发现生殖细胞非整倍体发生与母亲年龄密切相关[9]，随着妊娠年龄的增加，卵母细胞减数分裂过程中纺锤体形成障碍，染色体不分离的机率增高导致胚胎染色体非整倍体呈增高的趋势[10]。因此，要注重对高龄孕妇胎儿非整倍体的排查。

胎儿染色体非整倍体异常与NT增厚相关[11]，产科医生对于NT异常的胎儿要进行胎儿染色体非整倍体的筛查。本研究结果显示，NT异常组确诊7例胎儿染色体非整体，明显高于NT正常组(P<0.05)，同样证实NT在胎儿染色体非整倍体异常筛查中的有效性。NT异常往往合并胎儿结构异常[12]，NT异常对于及早发现胎儿心脏畸形及与评估染色体异常均有重要提示作用[13]，本次研究发现7例NT异常且染色体异常合并胎儿先天性心脏病的比率为42.9%(3/7)，故对NT异常的胎儿，孕期应行超声心动图对胎儿心脏结构的排查。

孕妇血浆cffDNA NIPT在高危孕妇人群中对胎儿非整倍体筛查的有效性已得到临床证实[14]，并且能够大大降低短期内产前诊断的孕妇人数[15]。对超声发现异常的病例，传统的染色体核型分析仍是有效的手段，而不是通过CMA检测[16，17]，我们CMA结果对此也有同样的验证，但上述观点与2014年染色体微阵列分析技术在产前诊断中的应用专家共识[18]胎儿结构异常是进行CMA检查的适应证观点不一致，有待于临床积累大量本的证据进一步积累胎儿结构异常遗传学检测手段如何选择。

NIPT技术是否可替代染色体核型分析用于高龄孕妇的胎儿非整体的筛查？ Norton等[19]对3228例血清学筛查高风险的孕妇在进行绒毛或羊水穿刺行染色体核型分析的同时采用NIPT 技术检测,结果表明NIPT技术在21-三体及18-三体的诊断价值与介入性产前诊断价值相当。段红蕾等[20]对不同指征介入性产前诊断异常染色体检出率研究发现，单纯以年龄≥35岁无胎儿结构异常的孕妇为穿刺指征的318例胎儿核型分析，未检出有临床意义的染色体异常。 我们此次对1161例接受NIPT统计，筛查发现非整倍体3例(21-三体高风险1例，45，XO 1例、47，XXX 1例)，核型确诊21-三体1例且胎儿彩超有鼻骨缺失改变，其余2例核型正常且胎儿超声无结构改变，因此对于NIPT检测后孕妇均需接受后续的胎儿系统结构彩超检查，一旦超声发现胎儿结构或胎儿超声软指标异常，结合该超声软指标的似然比及孕妇病史进行综合评估，不管是高风险还是低风险，均要接受规范的遗传咨询及进一步产前诊断方案。Petersen等[21]对35岁及以上的高龄孕妇、NT≥3.5 mm或超声发现胎儿结构异常研究发现，NIPT技术会漏检“非典型”的核型异常，因此不主张胎儿结构异常的高龄孕妇进行NIPT筛查。反之，我们本次研究发现，对于高龄孕妇即使NIPT低风险，中孕期胎儿结构彩超提示异常应接受有创的产前诊断进行胎儿遗传学检查。

综上所述，NT联合母血cffDNA NIPT在高龄单胎孕妇胎儿非整倍体管理中具有很高的筛查价值，能够在短期内大大减少有创产前诊断的例数，胎儿中期系统结构彩超作为两者筛查后仍是对胎儿非整倍体筛查的一种有效手段，对胎儿结构异常的孕妇均要接受规范的遗传咨询及进一步产前诊断方案。