外周血CTCs、cfDNA联合检测在肝癌早期筛查中的应用价值分析

阎其均 翁羽 朱付英

肝癌是我国临床常见恶性肿瘤，其发生率及死亡率较高，是威胁人类健康的重大疾病之一[1]。肝癌早期常无典型症状，多数患者明确诊断时已处于中晚期，错失最佳治疗时机，严重影响患者生存率。因此，对肝癌早期诊断、及时治疗显得尤为重要。

对穿刺获取或手术切除的病灶组织进行病理学检查是诊断肝癌的金标准，但肝穿刺会对患者造成一定程度损伤，另手术切除获取病理组织的方法只适用于确定行肝切除术的患者，因此，肝组织活检在临床诊断的应用中受到一定限制。循环肿瘤细胞（CTCs）是指自发或因诊疗操作而进入血液循环中的肿瘤细胞，cfDNA是指存在于外周血液的胞外DNA。CTCs和cfDNA对肿瘤的早期筛查及预后评估具有重要价值，可通过非侵入性操作取样，被称为“液体活检”[2]。有研究[3-5]表明，肿瘤患者血浆循环游离DNA（cfDNA）水平显著高于正常人；原发性肝癌患者外周血中含有CTCs；血浆cfDNA检测在胃癌的临床诊断中具有一定辅助作用。基于此，本研究探讨外周血CTCs联合cfDNA检测在早期肝癌筛查中的应用价值，为临床早发现、早治疗提供参考依据。

资料与方法

1 一般资料 选取我院2017年9月～2019年8月收治的182例高度疑似肝癌患者，其中男117例，女65例，年龄23～81岁，平均（48.96±8.17）岁。纳入标准：有肝区疼痛、食欲下降、腹胀、发热或乏力消瘦等症状，触诊时发现肝肿大或上腹部包块，超声或CT、MRI检查发现肝内有实质性占位者；入院后均接受外周血CTCs、cfDNA检测；意识清楚，无精神疾病；均知情同意且自愿参与。排除标准：有心肺肾等重要脏器疾病者；入院时已发现其他部位肿瘤或出现肿瘤转移者；有血液系统疾病者；纳入研究前1年曾接受过化疗、免疫治疗等。本研究已通过医院伦理委员会审批。

2 方法

2.1 试剂及仪器：血浆DNA提取试剂盒购自北京金麦格生物有限公司，抗荧光淬灭剂购自美国CST公司，红细胞裂解液购自中国SurEXam公司，甲醛溶液购自成都民生消毒剂有限公司，离心机购自Thermo公司，荧光显微镜购自日本尼康（Nikon）公司。血浆DNA提取试剂盒购自上海欧孚生物科技有限公司，SYBR Green Real Master Mix购自北京天根公司，离心机购自Thermo公司，分光光度计购自Thermo公司，荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司。

2.2 外周血CTCs检测：用EDTA-K2抗凝管采集患者术前空腹血5 mL，混匀后将5 mL血液置于样本保存管内，室温下放置30 min后离心5 min（3 000 r/min），弃上清，将管内剩余液体经过滤器过滤后，用甲醛溶液在室温下固定60 min；在24孔板中加入红细胞裂解液，将滤膜放入其中，室温孵育，去除液体，PBS冲洗3次；然后将滤膜放置入含探针工作液的24孔板中，40℃孵育3h，去除液体，洗涤3次，再将滤膜放入含扩增缓冲液的24孔板中，40℃孵育3 min，去除液体，洗涤3次，加入含显色工作液的24孔板中，40℃孵育30 min，去除液体，洗涤，最后将滤膜细胞面朝上而放置于载玻片上，在样本上加入抗荧光淬灭剂（含DAPI）后，放置5 min，在显微镜下观察结果。判断标准[6]：细胞内CD45(-)、EpCAM(+)、CK8/18/19(+)，显微镜下呈红色荧光信号，则判断为上皮型CTCs；细胞内CD45(-)、vimentin(+)、twist(+)，显微镜下呈绿色荧光信号，则判断为间质性CTCs；若细胞内同时呈现红色荧光和绿色荧光信号，则判断为混合型CTCs。

2.3 外周血cfDNA检测：用EDTA-K2抗凝管采集患者静脉血5 mL，离心15 min（3 000 r/min）分离血浆；以人基因组DNA为标准品，采用紫外分光光度计对其原始浓度进行测量，倍比稀释其浓度至400 ng/mL、40 ng/mL、4 ng/mL、0.4 ng/mL、0.04 ng/mL。内参使用ALU重复序列，引物序列上游：5'-CCTGAGGTAAGGTCAGCGAG-3'，下游：5'-CCCGAGTAAGGAGGATTACA-3'。根据标准品浓度梯度构建标准曲线，对待测样品进行定量检测，PCR总体系为20 μL，包括9 μL的SYBR Green Real Master Mix、上下游引物各1 μL、蒸馏水7 μL、模板2 μL；反应条件：94℃预变性1 min；94℃30s，62℃20s，72℃30s，共45个循环。所有样本均设3复孔，取其平均值。

3 统计学处理 应用SPSS21.0软件，计量资料用（ ±s）表示，两样本比较采用t检验，多样本比较采用单因素方差分析；外周血CTCs、cfDNA水平与肝功能指标、相关肿瘤标志物的关系采用Pearson相关性分析；另采用ROC曲线分析外周血CTCs、cfDNA联合检测对早期肝癌的筛查价值；P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 外周血CTCs、cfDNA检测结果 182例患者外周血CTCs平均为（3.45±0.69）个/5 mL，cfDNA平均为（17.26±3.51）ng/mL。

2 癌症组与良性组患者肝功能及肿瘤标志物水平比较根据病理学结果诊断分为癌症组139例，良性组43例（肝囊肿10例、肝脓肿13例、肝内胆管结石15例、肝血管瘤5例）。癌症组血清AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均高于良性组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

3 癌症组与良性组患者外周血CTCs、cfDNA水平比较 癌症组患者外周血CTCs、cfDNA水平均高于良性组，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表1 癌症组与良性组患者肝功能及肿瘤标志物水平比较（ ±s）

表2 癌症组与良性组患者外周血CTCs、cfDNA水平对比（ ±s）

4 癌症组患者外周血CTCs、cfDNA水平与肝功能指标及肿瘤标志物的相关性 经Pearson相关性分析发现，癌症组患者外周血CTCs、cfDNA水平与AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均呈正相关性（P＜0.05），见表3。

5 肝癌不同分期外周血CTCs、cfDNA水平比较 肝癌不同分期外周血CTCs、cfDNA水平比较差异具有统计学意义（P＜0.05），外周血CTCs、cfDNA水平肝癌Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期，见表4。

表3 癌症组患者外周血CTCs、cfDNA水平与肝功能指标及肿瘤标志物的相关性

6 诊断效能 经ROC曲线分析，外周血CTCs诊断肝癌的cut-off值为4个/5 mL，其灵敏度、特异度、AUC分别为75.54%、86.05%、0.854；外周血cfDNA诊断肝癌的cut-off值为19.38 ng/mL，其灵敏度、特异度、AUC分别为78.42%、79.07%、0.831；外周血CTCs联合cfDNA诊断肝癌的灵敏度、特异度、AUC分别为82.01%、90.70%、0.923。见图1及表5。

表4 肝癌不同分期之间外周血CTCs、cfDNA对比（ ±s）

表5 外周血CTCs、cfDNA单项及联合检测对肝癌的诊断效能

讨 论

肝癌属消化系统恶性肿瘤，多由病毒性肝炎、酒精性肝硬化或长期摄入黄曲霉素及亚硝胺等化学致癌物质所导致[7]。肝癌发病较为隐匿，初期多无明显症状，如何提高肝癌早期诊断率仍是现阶段临床关注的重点、热点问题[8]。肝组织活检是确诊肝癌的重要手段，但因其有创伤性，临床应用受到限制。因此，积极寻求早期筛查肝癌的其他方法具有重要的临床价值。

本研究中，182例高度疑似肝癌患者中确诊为肝癌的有139例，确诊为肝脏良性病变的有43例。与良性组比较，癌症组外周血CTCs、cfDNA水平明显升高，且CTCs、cfDNA水平随着肝癌分期逐渐升高，提示肝癌患者外周血CTCs、cfDNA水平异常上升，与肝癌临床分期密切相关。CTCs包括从肿瘤原发病灶、转移病灶脱落及诊疗操作导致进入血循环的肿瘤细胞[9]。有研究[10]显示，在肝细胞癌形成和生长早期，即有肿瘤细胞从实体瘤脱落而进入血液循环，并随着血行而转移。另有研究[11]显示，在296例肝细胞癌患者中，有191例患者（64.53%）外周血中检测到CTCs，也证实了多数肝癌患者外周血CTCs含量升高。此外，随着肿瘤进展，远处转移病灶增多，释放入外周血中的CTCs数量越多。cfDNA主要来源于细胞坏死或凋亡，与正常细胞凋亡产生较小的cfDNA片段相比，肿瘤细胞释放或肿瘤负荷状态下细胞坏死产生的cfDNA片段更大更多，这使得检测cfDNA的敏感性更高[12]。有研究[13]表明，肿瘤患者血液中cfDNA水平显著高于正常人，且cfDNA含有与肿瘤相关的某些分子特性或改变。另有研究[14]显示，肝细胞癌患者血浆cfDNA浓度中位值显著高于健康对照者、肝硬化及慢性活动性肝炎患者，本研究结果与此一致。肿瘤细胞恶性程度越高，经淋巴结转移或血行播散，从死亡的癌细胞释放入外周血的基因含量越高，因此分期越晚，cfDNA水平越高。另本研究结果显示，癌症组患者外周血CTCs、cfDNA水平与AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平均呈正相关性，表明CTCs、cfDNA水平与肝癌患者肝损伤程度一致。

CTCs来源于肿瘤原发病灶或转移灶，通过鉴定其计数及分子特征可一定程度地反映肿瘤特性，可作为肿瘤诊断的标记物[15]。原发性肝癌患者外周血CTCs与肿瘤体积及肿瘤分期显著相关[16]，外周血CTCs计数有成为诊断原发性肝癌生物标记物的潜在价值[17]。此外，肿瘤生长过程中可持续释放cfDNA至外周血中，并维持其来源的分子遗传性，可通过检测外周血cfDNA含量反映肿瘤的严重程度[18]。研究也证实[19]，血浆cfDNA在肝癌的临床诊断中具有一定的灵敏度及特异度。但有研究[20]显示，进入血液循环后有部分CTCs在机体免疫作用下发生凋亡，会导致漏检的发生。非肿瘤患者亦可出现cfDNA的改变，且遗传改变的cfDNA不能反映肿瘤类型及部位，因此，单一检测诊断价值有限。本研究结果显示，单独检测外周血CTCs、cfDNA筛查肝癌的灵敏度分别为75.54%、78.42%，特异度分别为86.05%、79.07%，二者联合检测灵敏度、特异度分别为82.01%和90.70%，提示外周血CTCs、cfDNA检测虽对肝癌有一定的诊断价值，但联合检测时诊断价值更高。

综上，肝癌患者外周血CTCs、cfDNA明显升高，与AFP、γ-GT、CEA、ALT、AST、ALP水平呈正相关，外周血CTCs、cfDNA水平检测对肝癌的早期筛查具有一定的临床价值，但此二者联合检测时的价值更高，可推广应用于临床中。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突