石家庄地区RhD变异型的分子背景研究*

乔芳 田亚娟 王远花 赵倩 何路军 王振雷

目前，在人类36个红细胞血型系统中，Rh血型系统是最复杂的，ABO血型系统仅次之，其与临床上与输血相关的疾病，例如新生儿溶血病、溶血性输血反应等关系密切[1]。在Rh血型系统中，包括5种血型抗原，即C、c、D、E、e抗原；其中免疫原性以D抗原最为强烈[2]。依据红细胞上有无D抗原的情况，将人类红细胞分为 RhD阳性与RhD阴性，即红细胞上缺乏D抗原则为RhD阴性；相反，存在D抗原的红细胞为RhD阳性。在中国人群中，大约占0.3%～0.5%的个体是RhD阴性。大多数D抗原采用盐水法即可检出，盐水法检测仅有少数结果为阴性，而采用间接抗人球蛋白（IAT）方法方可检出阳性，称该表型为 RhD变异型。RhD抗原包括多种变异型，按照 RhD抗原在红细胞上质和量的变化不同，将其分为弱D、部分D和Del型，统称为D变异型[3]。本研究采用阴性确认实验检测出弱D抗原，再分析D基因存在情况，进一步通过测序分析探讨RhD变异型的分子背景。

资料与方法

1 研究对象 血清学实验检出的D变异型（弱D或部分D）标本107例。

2 试剂与仪器 三批抗-D血清来源分别是IgM+IgG抗-D1(IMMUCOR，批号：517097)，IgM+IgG抗-D2(MILLIPORE，批号：BMA1402C)， IgG抗-D3（上海血液生物医药有限公司，批号：20150128）、抗-C（上海血液生物医药有限公司，批号：20143005）、抗-c（上海血液生物医药有限公司，批号：20153101）、抗-E（上海血液生物医药有限公司，批号：20153201）和抗-e（上海血液生物医药有限公司，批号：20153302）。TaqDNA聚合酶（PROMAGA，0000175632）；人类红细胞RhD血型-弱D（部分D）基因分型试剂盒（天津秀鹏生物技术公司，201603013，201603012）。仪器包括细胞洗涤离心机（ultracw）、医用低速离心机（珠海贝索生物技术有限公司，2005-2）、PCR扩增仪（ABI）、凝胶成像系统（KST-5500）、测序仪3730（ABI）。

3 方法

3.1 血清学实验：根据《中国输血技术操作规程》，确定收集样本的Rh系统五个抗原，即D、C、c、E、e。使用间接抗人球蛋白试验检出RhD变异型标本，试管法进行Rh抗原分型检测。

3.2 基因组DNA提取：依照TIANGEN血液基因组DNA纯化试剂盒说明书，提取基因组DNA并置于-20℃保存备用。

3.3 RhD基因特异性外显子的PCR检测

3.3.1 序列特异性引物（sequence specific primers,SSP）设计：根据文献Maaskant-van Wijk等[4]设计的RHD基因特异性PCR引物序列，对RHD基因特异性外显子3、4、5、6、7、9进行序列特异性扩增，同时扩增内对照引物HGH（human growth hormone, HGH）（见表1）。

3.3.2 PCR-SSP检测：PCR反应条件为：95℃，2 min,35个循环，（每个循环为95℃，30 s, 54℃，45 s,72℃，1 min），最后72℃，10 min延伸。经2%琼脂糖凝胶电泳后，PCR产物经凝胶成像系统拍照并分析结果。

3.4RHD基因序列分析

3.4.1 10个外显子的扩增：引物序列见表2。按以下参数进行PCR扩增：96℃ 2 min，1 cycle；96℃20 s68℃60 s5 cycles；96℃20 s64℃50 s72℃1.5 min，10 cycles；96℃20 s61℃50 s72℃1.5 min，25 cycles；72℃5 min，1 cycle。将每个PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳15～20 min后，观察特异性扩增效果。

3.4.2 测序反应：测序条件：96℃ 20 s、50℃ 30 s、60℃ 2 min，25 cycles；4℃ ∞。应用ABI基因测序仪进行测序，使用Chromas2.31阅读测序图谱，对测序结果进行分析。

表1 RHD特异性外显子的PCR-SSP引物序列及扩增产物大小

表2 PCR扩增RHD10个外显子的测序引物序列

结 果

1 血清学分析 经IAT确认为D变异型的样本，用PCR-SSP方法检测出弱D基因型93例（图1），即均可检测到RHD特异性外显子；部分D基因型14例，即检测发现RHD特异性外显子有缺失（图2）。

2 RhD变异型中Rh表型分布和RHD外显子缺失情况见表3。

3 RhD变异型中部分D标本的基因型检测 对检出的14例部分D的标本进一步应用SSP方法进行基因分型，11例均为D cat.VI type3*型（图3）。

4 RhD变异型中弱D标本的基因型检测 对弱D标本进行基因型的检测，已检测93例弱D表型，58例均为弱D15型（图4）。

5 SBT分析 5例未检测出基因分型的标本进行RHD10个外显子的测序分析，1例为RHD weakD 779G（图5）；1例为RHD weakD type4.0（图6）；另外3例均检出在第1外显子第22碱基T突变成C（图7），且该突变的基因型在美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）无对应的基因型。

表3 Rh表型分布和RHD外显子缺失情况

讨 论

RhD血型在不同人种中分布比例存在较大差异，如中国的汉族和蒙古族人群中，RhD阴性属于稀有血型[4]。弱D和部分D，DEL型统称为D变异型；但弱D和部分D在机理上存在很大的不同，即弱D抗原的改变，是发生在细胞膜中和膜内的，且只有抗原数量的改变，在质量上没有变化；而部分D抗原则不同，其改变发生在细胞膜外，且抗原的数量和性质都发生了变化[5]。几乎所有国家的输血前检测项目中均规定，对供血者和受血者的RhD抗原进行鉴定。一般输血前RhD鉴定方法是采用血型血清学方法先对血样进行初步定型，若与抗-D试剂反应呈阴性，需进行RhD阴性确认试验，以便确认检测样本的红细胞上是否携带RhD抗原[6]。在国内外，弱D表型的分布比例存在很大差别。白种人中弱D的主要存在的表现型是弱D1、弱D2和弱D3型，三者总和约占90%[7]；在浙江地区，检出9例弱D表型，其中有5例为弱D15型，而弱D15型则是中国华北地区弱D的主要表型，约占56.3%[8，9]。本研究发现，河北地区汉族人群D变异型的分布具有多样性，血清学试验检出D变异型（弱D或部分D）标本107例，经PCR-SSP检测，检出部分D基因型14例，弱D基因型93例。

RH血型基因，位于人类染色体1p34.3～36.1，是由RHD和RHCE紧密连锁而成，两个基因呈串联排列；它们皆是由10个外显子组成，编码区总长均为1 251 bp，编码D抗原和CE抗原，均是417个氨基酸组成的糖蛋白。任何座位上的基因突变，都可能导致抗原的结构改变[10]。商品化的抗-D试剂与D抗原位点相结合，不同的试剂，对应不同的抗原决定簇发生反应，其凝集强度就会有差别。总之，不同商品化的抗-D试剂与D变异型红细胞反应时，反应格局和强度均有所不同[11]。RHD基因与RHCE基因具有高度同源性（约96%），两者之间仅有40个核苷酸不相同，分别位于RHD基因和RHCE基因的第3、4、5、6、7、9外显子。因此，在PCR扩增反应中，RHD特异性碱基均位于扩增引物的3'端，且能准确的检测出RHD基因的完整性[12]。本研究采用PCR-SSP方法对检出的107例D变异型标本进行了弱D和部分D的基因分型，检出14例部分D的标本中，11例为D cat.VI type3*型；1例为D cat.Va type2*型；1例为D cat.Va type4型；1例为RhD-CE(5)-D。对93例弱D标本进行基因型的检测，检出58例为弱D15型；20例为弱D15型与1227ADEL杂合型；6例为1227A DEL型；4例为D24型；另外5例未检出分型结果的标本经进一步测序确认，1例为RHD weakD 779G；1例为RHD weakD type4.0；另外3例均检出在第1外显子第22碱基T突变成C，且该突变的基因型在NCBI无对应的基因型。

研究表明，中国人群中最常见的弱D基因型是弱D15型，它是由于RHD基因位于编码区的碱基突变而造成D抗原减弱的。另外，亚洲人群中较为常见的有弱D24型、弱D1型、弱D6型和弱D17型等。经研究证实，大多数弱D表型，均携带有变异的RhD蛋白。为确保弱D阳性血输血的安全性，需要进一步完善RhD血型的鉴定标准，且对于弱D表型患者，有针对性得改进输血的策略[13]。有研究报道，弱D或部分D个体都有可能存在产生抗-D抗体的风险[14]。RhD变异型具有不同的分子背景，因此对D抗原产生不同的免疫反应[15]。因此，对于RhD变异型的鉴定，采用基因分型研究D变异型的分子背景是一种有效的方法[16]，建立简便准确的基因定型方法，对于临床安全、科学、合理用血以及孕妇、新生儿溶血病的预防，有针对性地制定输血策略，输血相关疾病的诊断及治疗方面都具有十分重要的临床意义。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突