氮源调控Schizochytrium sp. DP-16发酵产DHA油脂

2020-08-13刘尧，刘成晟，成艳，陈明

大连工业大学学报 2020年3期

刘尧，刘成晟，成艳，陈明

( 大连工业大学生物工程学院, 辽宁大连 116034 )

0 引言

二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的ω-3多不饱和脂肪酸，具有促进脑细胞发育、增强视力、预防和治疗心脑血管疾病等生理功效[1]，被誉为新一代功能因子，广泛用于食品医药行业。传统的DHA主要来源于深海鱼油，但鱼油的品质与产量难以满足商业化发展需求。裂殖壶菌(Schizochytriumsp.)是一种富含DHA的海洋真菌，具有生长速度快、易于培养、细胞内油脂含量高等优点，是商业化生产DHA的理想菌种之一，利用Schizochytriumsp.生产DHA已成为目前国内外的研究热点[2-3]。近年来，关于裂殖壶菌生产DHA油脂的报道更多地集中在发酵工艺和培养条件[4-5]，产量问题一直不理想。氮源对微生物菌体生长、油脂合成启动、油脂产量和油脂组成等均产生重要影响[6-7]。本实验利用一株Schizochytriumsp. DP-16发酵产DHA油脂，研究了不同氮源对DHA油脂生成的调控作用，以期为微生物发酵产DHA油脂的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

Schizochytriumsp. DP-16，本实验室保藏。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨2，海水晶15，pH 6.0。

初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖80，酵母浸粉5，海水晶15，MgSO4·7H2O 5，KH2PO4·H2O 7；pH 6.0。

1.1.3 试剂与仪器

葡萄糖、MgSO4·7H2O，天津大茂化学试剂厂；酵母浸粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；海水晶，山东强隆海水晶厂；KH2PO4·H2O，天津科密欧化学试剂有限公司；三氟化硼-甲醇，上海安谱科学仪器有限公司。

Agilent Technologies GC 7890气相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 种子液制备

将甘油管接种于斜面后，在25 ℃条件下培养48 h，用接种环挑取4～5环接入装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，25 ℃、160 r/min振荡培养48 h。

1.2.2 摇瓶发酵

按10%的接种量将种子液接入装有30 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，在25 ℃、160 r/min条件下振荡培养96 h。

1.2.3 有机氮源对DHA油脂生成的影响

在初始发酵培养基中分别添加牛肉膏、玉米浆、蛋白胨、酵母浸粉4种有机氮源，添加量为5、10、15 g/L，测定油脂的产量。

1.2.4 添加谷氨酸钠对DHA油脂生成的影响

分别添加谷氨酸钠5、10、15 g/L，摇瓶发酵96 h，测定油脂的产量。

1.2.5 无机氮源对DHA油脂生成的影响

分别添加硝酸钠、硫酸铵、氯化铵3种无机氮源，添加量为0.5、1.0、1.5 g/L，摇瓶发酵96 h，测定油脂的产量。

1.2.6 分析方法

采用细胞干重法测生物量；采用磷酸香草醛法测油脂产量[8]；采用DNS法测定葡萄糖含量；采用靛酚蓝分光光度法测溶氨含量[9]。

1.2.7 油脂总脂肪酸中DHA含量的测定

脂肪酸的甲酯化：在5 mL离心管中，加入发酵液1 mL和去离子水3 mL，8 000 r/min离心15 min，在离心后的沉淀中分两次加入7 mL 1 mol/L氢氧化钠-甲醇试剂，吸打沉淀完全后转入50 mL磨口瓶，在70 ℃水浴条件下皂化反应30 min，反应结束后继续加入7 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在70 ℃水浴条件下发生甲酯化反应30 min，反应完毕后放置常温下冷却，继续加入饱和氯化钠10 mL 和正己烷试剂3 mL，摇匀后取上层有机相过膜用于气相分析。

气相色谱条件：HP-5MS弹性石英毛细管色谱柱(5%苯甲基硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度260 ℃；FID检测器，温度280 ℃；载气为氮气，体积流量1 mL/min，进样量1 μL，分流比1∶10；采取程序升温：初始温度140 ℃，维持5 min，以4 ℃/min升温至240 ℃，维持15 min。

根据脂肪酸各成分峰面积，采用峰面积归一法计算DHA含量。

2 结果与讨论

2.1 有机氮源对DHA油脂生成的影响

不同种类的有机氮源对产油微生物的生长和发酵有着不同的作用[10]。基础发酵培养基分别添加质量浓度5、10、15 g/L的牛肉膏、玉米浆、蛋白胨、酵母浸粉为有机氮源，以基础培养基为对照，培养96 h，对生物量和油脂产量进行测定，结果如图1所示。从图1可以看出，以牛肉膏作为氮源时，油脂产量随着氮源添加量的增加而下降。以玉米浆为氮源，随着氮源添加量的增加，油脂产量先下降后回升，但产量均低于对照组，油脂产量整体偏低。以蛋白胨为氮源时，油脂产量先上升后下降。在4种氮源中，酵母浸粉促进产油显著，油脂产量整体偏高，添加量为15 g/L时，油脂产量最高，相比对照组提高了16.9%。

以牛肉膏和酵母浸粉为氮源时，随着氮源浓度的增加，生物量不断上升，酵母浸粉作为氮源添加时，生物量上升幅度达40%；玉米浆和蛋白胨为氮源时，生物量也出现过不同幅度的上升，氮源浓度高更倾向于促进裂殖壶菌生物量的生成。结果表明通过有机氮源来调控裂殖壶菌等产油微生物产油是一种好的研究思路。

2.2 添加谷氨酸钠对DHA油脂生成的影响

在添加15 g/L酵母浸粉条件下，分别添加5、10、15 g/L谷氨酸钠，培养96 h，对生物量、油脂产量和DHA占总脂肪酸的质量分数进行测定，结果如图2所示。从图2可以看出，在3种质量浓度谷氨酸钠添加条件下，油脂产量和DHA占总脂肪酸的质量分数相比对照组分均有所提高。在添加谷氨酸钠质量浓度10 g/L条件下，油脂产量和DHA占总脂肪酸的质量分数最高，分别为22.8 g/L和36.6%。添加谷氨酸钠的生物量、油脂产量和DHA占总脂肪酸的质量分数均高于对照组，说明谷氨酸钠可以作为一种良好的外源添加剂促进裂殖壶菌细胞生长和油脂发酵，且应控制其添加质量浓度。

2.3 无机氮源对DHA油脂生成的影响

陆向红等[11]发现无机氮源对于产油微生物的生长和DHA油脂合成有作用，其中硝态氮和非硝态氮作用不同。谢辰等[12]发现以酵母浸粉为有机氮源，添加硝酸钠，其菌体生物量、油脂产量和DHA产量均达到最高。本实验中，在添加10 g/L谷氨酸钠条件下，分别添加0.5、1.0、1.5 g/L 硝酸钠、硫酸铵和氯化铵，培养96 h，对生物量、油脂产量和DHA占总脂肪酸的质量分数进行测定，结果如图3所示。3种无机氮源中，实验组的油脂产量均低于对照组。随着氮源浓度的增加，硝酸钠作为无机氮源时，DHA占总脂肪酸的质量分数呈先升高后下降趋势，但均低于对照组；硫酸铵和氯化铵作为无机氮源时，DHA占总脂肪酸的质量分数不断升高，1.5 g/L达到最大，高于对照组。

(a) ρ=5 g/L

(b) ρ=10 g/L

在3种无机氮源中，硫酸铵和氯化铵都能提高DHA占总脂肪酸的质量分数，陈胜兰等[13]发现添加硫酸铵能提高裂殖壶菌中不饱和脂肪酸的含量，与本实验结果相符合。其中氯化铵作用最明显，在质量浓度1.5 g/L达到41.5%，比对照组提高了17.5%，其气相谱图如图4所示。从图4可以看出，DHA出峰时间在31.600 min。裂殖壶菌虽能利用一定浓度的无机氮源提高DHA占总脂肪酸的质量分数，但不促进产油。

图2 不同谷氨酸钠质量浓度下DHA油脂的发酵情况

(a) ρ=0.5 g/L

(b) ρ=1.0 g/L

图4 1.5 g/L氯化铵条件下脂肪酸组成气相峰谱图

2.4 不同氮源种类和浓度下油脂发酵进程的分析

取酵母浸粉15 g/L和谷氨酸钠10 g/L复配，以初始氮源条件为对照组观察油脂发酵进程。每12 h取样，对发酵过程中的生物量、油脂产量、残糖量和溶氨量进行测定，发酵96 h，结果如图5所示。实验组初始溶氨量比对照组高，氮源均在12 h被大量消耗。Ratledge等[14]研究发现，当氮源消耗殆尽时，产油微生物细胞内积累的乙酰辅酶A进入脂肪酸合成途径，油脂开始积累。从图5(b)可以看出，12 h前主要以菌体生长为主，油脂产量较少；12 h后油脂开始加速积累，微生物继续利用碳源，至96 h，葡萄糖基本耗尽，此时生物量和油脂量达到最大，分别为52和21.7 g/L。从图5(a)可以看出，对照组的残糖量较实验组高，生物量和油脂量远低于实验组。

3 结论

在基础发酵培养基中分别添加不同种类和质量浓度的有机氮源牛肉膏、玉米浆、蛋白胨和酵母浸粉，结果表明，酵母浸粉对于裂殖壶菌产油促进明显。谷氨酸钠可以作为一种良好的外源添加剂。在3种无机氮源硝酸钠、硫酸铵和氯化铵中，硫酸铵和氯化铵能提高DHA占总脂肪酸的质量分数，裂殖壶菌虽能利用一定浓度的无机氮源提高DHA占总脂肪酸的质量分数，但不促进产油。