宫颈病变病理诊断中P16及ki67的运用

张晓野，于冉冉，郭海燕

(山东中医药大学第二附属医院病理科，山东 济南)

0 引言

宫颈癌是一种对女性健康存在严重威胁的恶性肿瘤性疾病，在其筛查过程中，宫颈组织活检病理直接关系到患者的处理方式。宫颈癌疾病中的原位癌多发于30～35岁女性，而浸润癌多发于45～55岁女性，近几年，该病年轻化趋势也日益明显。宫颈癌按级别不同给予不同的诊断与治疗方法，其中低级别鳞状上皮病变(LSIL)以下患者需进行定期复查；而高级别鳞状上皮病变(HSIL)以上患者，按患者病情需给予leep刀或宫颈锥切。为避免因组织学假阳、假阴性结果而出现过度或延误患者治疗情况，加强对宫颈病变组织学本质的准确识别具有重要作用。

据国外多个研究结果[1-2]显示：不同病理医师进行单独宫颈活检组织常规HE切片时，对患者宫颈病变的诊断不仅差异较大，还存在较低的重复性，Kappa值在0.2～0.5之间，呈低中度。对于部分难以诊断的病例，临床多数采用由多个病理医师进行分别诊断，最后以讨论的方式得出一个一致性诊断意见。但部分基层医院由于缺乏病理医师，当无确切诊断结果时，需进行会诊，而这种会诊不仅耽误了患者的治疗时间，还增加了病人的花费。因此，为减轻患者经济负担，不耽误患者病情，通过可靠、客观的指标增强病理医师对患者疾病的准确诊断是至关重要的。

由研究结果[3-4]可知：高级别鳞状上皮病变(HSIL)与P16及Ki67的强表达存在较为密切的关系。本文为提高病理医师对宫颈癌上皮病变诊断的准确性，运用P16与Ki67，并分析其临床诊断意义。

1 材料与方法

1.1 材料

在我科室自2017年1月至2018年6月进行的宫颈活检病例中进行搜集，参与活检的组织均固定于中性福尔马林中，由德国Leica公司生产的ASP200脱水机对活检组织进行脱水、透明及浸蜡处理，石蜡包埋后，对常规石蜡HE与免疫组织进行化学切片，切片厚度为3μm。

纳入标准：所有活检病例均使用阴道镜下宫颈活检标本；参与本次实验的活检组织均由中性福尔马林予以固定；所选病例均不不包括浸润性鳞癌、合并其他肿瘤及腺上皮病变患者；排除标准：排除活检组织病灶太小、无法进行重新连续切片及活检组织中无鳞状上皮的病例；排除由2名副主任级别以上病理医师通过阅片无法形成一致性意见的活检组织常规HE切片病例。我科室通过筛选，从众多病例中抽选出207例病例，其中正常病例为114例，低级别鳞状上皮病变(LSIL)37例，高级别鳞状上皮病变(HSIL)56例。

1.2 方法

由我科室4名病理医师依据TBS诊断系统对207例病例通过常规HE染色与P16，Ki67免疫组织化学染色进行2次诊断，诊断主要分为正常、低级别鳞状上皮病变(LSIL)及高级别鳞状上皮病变(HSIL)三种结果。第一次诊断主要由各病理医师以阅读常规HE染色切片进行，并对诊断结果进行记录与统计，对各医师所作诊断结果进行一致性与符合率计算，其中一致性由Kappa值表示；第二次诊断再次由4名病理医师在3个月后根据P16、Ki67免疫组织化学切片进行，为获得诊断一致性，对比各医师诊断结果，再次对病理医师的阅片Kappa值、符合率进行计算。最终依据参考标准，对4名医师的诊断结果进行一致性与符合率比较，并对其统计学意义进行分析。

1.2.1 免疫组织化学染色方法(P16及Ki67)

选用中杉金桥公司提供的P16及Ki67抗体，对P16与Ki67分别应用10与K2的克隆号进行手工染色，选取显色为ER2，DAB的抗原修复液进行苏木精复染，对免疫组织化学染色按批次不同分别设置阳性与阴性对照。P16与Ki67免疫组织化学阳性结果判读依据分别为：1)病变上皮大于中下一半范围，呈弥漫连续棕黄色表达；2)病变上皮中表层呈弥漫性棕黄色表达，P16阳性表达部位为胞浆及细胞核；Ki67阳性表达部位为细胞核。

表1 常规HE切片与P16及Ki67免疫组织化学染色诊断对比表(n,%)

表2 以参考标准为依据，比较病理医师诊断结果一致性

1.2.2 参考标准

将经2名副主任以上级别医师阅片所得的一致性诊断结果作为临床参考标准。

1.3 统计学处理

所有诊断数据均由SPSS 19.0软件进行统计与分析。诊断结果一致性的判断方法主要是通过Kappa检验完成，以Malpica等[5]为依据，根据Kappa值，将其分为弱、中、高与极强四个级别，其中Kappa值低于0.4为弱；Kappa值在 0.4～0.6范围内为中度；Kappa值在0.6～0.8为高度；Kappa值在0.8～1.0范围内为极强。符合率与参考标准等指标均由计数(n，%)与计量()资料表示，组间行χ2与t检验，当P＜0.05时，组间差异存在统计学意义，其中符合率公式为：诊断符合例数/总数×100%。

2 结果

2.1 对比各病理医师诊断结果的一致性

不同病理医师进行单独宫颈活检组织常规HE切片时，对患者宫颈病变的诊断不仅差异较大(0.259≤ Kappa值≤ 0.480，0.343±0.138)，呈弱至中等一致性，符合率较低( 55%～70% )。第二次阅片于3个月后进行，除进行常规HE切片外，还给予P16及Ki67免疫组织化学染色诊断，病理医师诊断结果一致性与符合率均较第一次有明显提升，Kappa值：(0.648≤Kappa值≤ 0.804，0.707±0.098)，符合率升高至 78%～88%，P＜0.05(见表 1)。

2.2 以参考标准为依据，比较病理医师诊断结果一致性

不同病理医师进行单独宫颈活检组织常规HE切片时，对患者宫颈病变的诊断不仅差异较大 (0.344≤ Kappa值≤ 0.458，0.431±0.040)，呈弱至中等一致性，符合率为60%～65%，明显较低。第二次阅片于3个月后进行，除进行常规HE切片外，还给予P16及Ki67免疫组织化学染色诊断，参考标准与医师诊断一致性较第一次阅片结果，均存在显著提高，Kappa值：(0.739 ≤ Kappa值 ≤ 0.853， 0.799±0.055)，符合率提升至85%～91%，P＜0.05。

3 讨论

作为一种仅次于乳腺癌的恶性肿瘤疾病[6]，宫颈癌的发病率已位居女性恶性肿瘤疾病的第二名，对女性的身体健康与生命安全存在严重威胁。宫颈活检病理诊断对宫颈癌疾病的预防与治疗意义较为重大，其活检结果不仅可为医生进行进一步诊断提供正确的指导，其病理结果还方便医生为患者制定下一阶段的临床诊疗方案。由近些年国外的相关研究结果[7-8]可知，病理医师对宫颈病变病理仅进行常规HE切片诊断时，其重复性仅表现为中度，但在常规HE切片诊断基础上，添加P16及Ki67免疫组织化学染色，其诊断一致性与则呈高度与极强重复性。从宋建明等[9]关于宫颈非典型不成熟化生与其类型病变诊断结果一致性的探讨可知，不成熟化生和CINIII经不同评估者进行诊断，其诊断结果一致性较高，而非典型性不成熟化生、湿疣、CINI和CINII的精不同评估者进行诊断，其诊断结果一致性却并不高，甚至可以用较差来形容，但对于两者之间的解决方案，作者却并未予以阐述。基层医院受我国医疗体系建制问题影响，其病理可诊断力量相对薄弱，无法有效保障其病理诊断准确性。为提升基层医院病理科对宫颈病变病例的临床诊断准确性，增强相关客观辅助诊断指标的寻找对提升该疾病的诊断结果的一致性具有重要意义。作为一种与高危型人乳头状瘤病毒感染存在密切关联的细胞周期依赖激酶抑制因子，其癌基因蛋白E7灭活细胞因对Rb蛋白具有调控作用，易使P16出现过表达。由研究结果[10-11]发现：作为一种效果理想的预后观察指标，P16的过表达与高级别鳞状上皮病变(HSIL)与存在较为密切的关系。而Ki67表达范围较为明显，可表达于除G0期外的任何细胞增殖周期，其中正常宫颈上皮中的Ki67对基底层及副基底层细胞均可表达，宫颈病变中Ki67的表现也较为明显，一般为全层鳞状上皮弥漫阳性表达[8]。随P16与Ki67免疫组织化学指标在临床的广泛应用，其对我国病理医师提升宫颈病变诊断结果一致性具有重要作用。

综上所述，病理医师在进行单独常规HE切片诊断时，其所得到的诊断结果与参考标准的一致性主要呈弱至中度，且符合率均较低，但随P16及Ki67免疫组织化学染色的加入，医师诊断结果与参考标准一致性逐渐提升至高度至极强，符合率也随之大幅度提升。由此可知，在常规HE切片检测基础上，添加P16及Ki67免疫组织化学染色检验，不仅提升了宫颈活检病变的诊断准确率，还提升了P16及Ki67两个指标对宫颈病变诊断的辅助作用，增加了宫颈病变病理结果的可靠性，为医生提供进一步治疗提供科学依据。