原钙黏蛋白10对胃癌顺铂化疗敏感性的影响及作用机制初探

郭锦涛，李俊，岳德亮

信阳市中心医院普通外科，河南 信阳 464000

胃癌是一种上消化道恶性肿瘤，发病率和病死率均居恶性肿瘤前列，随着生活节奏的加快及饮食结构的转变，胃癌发病率逐年升高[1]，严重威胁患者的生命健康。目前，临床常采用规范化手术、放化疗等综合治疗方案治疗胃癌，但部分中晚期患者仍可发生远处转移，预后不良[2]。肿瘤细胞多药耐药是预后不良的重要因素，顺铂作为胃癌化疗的一线药物，其耐药性受到临床广泛关注。原钙黏蛋白10（procadherin 10，PCDH10）属于钙黏蛋白超家族亚群成员，多项研究表明，PCDH10是一种肿瘤细胞抑制基因[3-5]，在舌鳞状细胞癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞中均呈异常低表达，参与肿瘤发生发展进程。目前，关于PCDH10对顺铂化疗敏感性影响及机制的研究较少。多种恶性肿瘤中均存在磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又称AKT）通路异常激活，且该通路存在一个重要的下游信号分子，即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR），而p70核糖体蛋白S6激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70S6）是MTOR的直接底物，该通路在促进肿瘤放化疗抵抗上具有重要作用[6-7]，由此推测，PCDH10可通过调控PI3K/AKT/MTOR/p70S6通路参与胃癌对顺铂的耐药进程。为验证该猜想，本研究通过建立过表达PCDH10的人胃癌BGC823细胞株，探讨PCDH10对顺铂化疗敏感性的影响及作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人胃癌BGC823细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，pcDNA3.1+PCDH10质粒、pcDNA3.1+空质粒均购自云舟生物科技（广州）有限公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清、lipofectamineTM2000试剂盒均购自美国Amresco公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析试剂盒、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均购自美国Sigma公司，荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒均购自日本TCI公司，lipofectamineTM2000试剂盒购自日本Takara公司。NIB900-FL型倒置荧光显微镜购自广州市明慧科技有限公司，7500 Real-Time定量PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific-CN公司，Spectra Max iD5酶标仪购自美国molecular devices公司，PE2400电泳仪、GelDOC2000型凝胶成像分析系统均购自美国Bio-Rad中国公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及转染 人胃癌BGC823细胞株接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，37℃恒温、恒湿箱，5% CO2环境中孵育培养。取对数期细胞接种于24孔板，细胞长满75%瓶底面积时，更换为无双抗的完全培养基。严格按照LipofectamineTM2000脂质体说明书进行转染，将pcDNA3.1+PCDH10质粒、pcDNA3.1+空质粒转染至人胃癌BGC823细胞株，分别作为转染组、空载组，转染36 h后采用荧光显微镜观察转染效果，将未作任何处理的BGC823细胞株作为空白组。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR检测PCDH10mRNA 的相对表达量 收集转染36 h后的转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞，Trizol法裂解提取总RNA，取1 μg经逆转录试剂盒逆转录获取互补DNA（complementary DNA，cDNA）。按照Takara SYBR Green荧光定量试剂盒要求进行反转录，反应条件：94℃ 10 min，1个循环；52℃ 28 s，72℃28 s，共30个循环，以U6为内参，共22个循环，最后70℃延伸2 min。PCDH10正向引物：5'-TTGACCAGTTGCAGCATGAACG-3'，反向引物 ：5'-GTGAACCTGACTTAGGCACGCC-3'；U6正向引物：5'-TAGCCAGTTGCAGCACCTTATA-3'，反向引物：5'-GGTAGAGACGCCGTGCGCATAC-3'。实验重复3次取平均值。

1.2.3 蛋白质印记法（Western blot）检测PCDH10蛋白的相对表达量 按照蛋白提取试剂盒要求获取转染36 h后的转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞总蛋白，BCA法定量，常规变性后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，经电转仪转至硝酸纤维膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗（稀释浓度为1∶500）、二抗（稀释浓度为1∶1000）孵育1 h，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，以β-actin为内参，采用Fusion软件计算目的蛋白的相对表达量。实验重复3次取平均值。

1.2.4 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞增殖情况 取稳定转染的转染组、空载组、空白组人胃癌BGC823细胞，重新调整细胞密度，以1.0×104/ml接种于96孔板，每孔200 μl，每组设置5个复孔。培养至24、48、72 h时，每孔加入20 μl新制备MTT溶液（浓度为5 μg/μl），继续培养4 h后丢弃上层培养液，每孔加入150 μl的DMSO溶液，震荡均匀后采用酶标仪测定570 nm波长处光密度（optical density，OD）值。实验重复3次取平均值。

1.2.5 划痕试验检测细胞迁移能力 取稳定转染的转染组、空载组及空白组人胃癌BGC823细胞，胰蛋白酶消化、重悬；采用无血清培养基洗涤2次后，以2.0×104/ml接种于6孔板，孵育过夜，细胞铺满底壁后丢弃培养基；采用2 μl无菌枪头划痕，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）轻吹去除划下细胞，加入完全培养基孵育24 h后取样、拍照。细胞迁移率（%）=（初始划痕宽度-24 h后划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.2.6 Transwell小室检测细胞侵袭能力 收集稳定转染的转染组、空载组及空白组人胃癌BGC823细胞，加入无血清培养基培养12 h，调整各组细胞浓度为2.0×105/ml。于孔径8 μm、24孔的Transwell小室的上室中加入200 μl各组细胞悬液，下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于孵箱中孵育24 h后取出小室。取少量悬液置于计数板中，于显微镜下观察穿过滤膜进入下室下腔的细胞数量。

1.2.7 PCDH10对不同浓度顺铂的敏感性 取稳定转染的转染组、空载组及空白组人胃癌BGC823细胞，胰蛋白酶消化，重悬，以5.0×103/孔接种于96孔板，每组设置5个复孔。依次分别向转染组、空载组及空白组细胞中加入顺铂，使终浓度分别为0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml。采用 MTT法测定570 nm处OD值，细胞存活率（%）=（各浓度OD值-空白组OD值）（/0 μg/ml OD值-空白组OD值）。根据曲线计算顺铂对BGC823细胞的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.8 实时荧光定量PCR检测PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA 的相对表达量 取部分稳定转染的转染组、空白组人胃癌BGC823细胞，胰蛋白酶消化，重悬，以5.0×103/孔接种于96孔板。分别加入IC50浓度的顺铂溶液，即浓度为4.000 μg/ml的顺铂溶液，分别作为转染+顺铂组、顺铂组。培养48 h后，胰蛋白酶消化，重新收集稳定转染的转染组、空白组细胞及转染+顺铂组、顺铂组细胞，采用实时定量RT-PCR法测定4组细胞中PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA的相对表达量，以β-actin为内参，重复3次取Ct平均值，以2-△△CT计算目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.9 Western blot检 测PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白的相对表达量 重新收集稳定转染的转染组、空白组细胞、顺铂组、转染+顺铂组细胞，PBS冲洗后，加入裂解液冰上裂解35 min，4℃以11 000 r/min离心25 min，取上清；每孔加入200 μl的BCA混合液，经SDS-PAGE电泳分离，转膜后封闭1.5 h，加入一抗、二抗孵育，取出条带漂洗，避光显影，以β-actin为内参采用Fusion软件计算各条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 25.0软件对所有数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCDH10mRNA及PCDH10蛋白相对表达量的比较

转染组细胞PCDH10mRNA及PCDH10蛋白的相对表达量，均高于空载组和空白组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；空白组和空载组PCDH10mRNA及PCDH10蛋白的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.2 增殖能力的比较

稳定转染转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞重新接种并培养24、48、72 h时，转染组细胞OD值均低于空载组和空白组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；空白组和空载组细胞OD值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表2 转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞PCDH10 mRNA及PCDH10蛋白相对表达量的比较（±s）

表2 转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞PCDH10 mRNA及PCDH10蛋白相对表达量的比较（±s）

注：a与空白组细胞比较，P＜0.05；b与空载组细胞比较，P＜0.05

组别空白组空载组转染组F值P值0.3 1±0.0 6 0.3 4±0.0 5 0.9 1±0.0 9 a b 1 2 0.7 3 9 0.0 0 0 0.2 8±0.0 2 0.3 0±0.0 4 0.8 8±0.1 0 a b 1 4 5.1 6 7 0.0 0 0 P C D H 1 0 m R N A P C D H 1 0蛋白

表3 转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞增殖能力比较（±s）

表3 转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞增殖能力比较（±s）

注：a与空白组细胞比较，P＜0.05；b与空载组细胞比较，P＜0.05

空载组0.3 0 8±0.0 2 1 0.5 6 0±0.0 5 9 0.8 0 3±0.0 7 8时间2 4 h 4 8 h 7 2 h空白组0.3 0 1±0.0 1 9 0.5 5 7±0.0 6 1 0.7 9 6±0.0 8 1转染组0.1 5 6±0.0 1 3 a b 0.2 6 3±0.0 3 1 a b 0.4 0 9±0.0 4 9 a b F值1 1 3.7 4 4 5 3.4 9 0 5 0.6 8 7 P值0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.3 迁移和侵袭能力的比较

培养24 h时，转染组细胞迁移率和穿膜细胞数均低于空载组、空白组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；空载组和空白组细胞迁移率和穿膜细胞数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表4）

表4 转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞迁移率和穿膜细胞数的比较（±s）

表4 转染组、空载组和空白组人胃癌BGC823细胞迁移率和穿膜细胞数的比较（±s）

注：a与空白组细胞比较，P＜0.05；b与空载组细胞比较，P＜0.05

组别空白组空载组转染组F值P值8 1.0 2±5.9 4 8 3.1 1±5.2 6 5 3.9 7±4.5 8 a b 4 7.2 2 0 0.0 0 0 1 1 4.8 6±1 8.9 0 1 1 9.3 3±1 9.0 4 4 1.0 6±5.9 1 a b 3 8.4 0 3 0.0 0 0迁移率（%）穿膜细胞数

2.4 不同顺铂浓度细胞存活率及IC50的比较

顺铂浓度分别为 0.500、1.000、2.000、4.000、8.000 μg/ml时，转染组细胞存活率均低于空载组和空白组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；空载组和空白组细胞存活率比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表5）。转染组顺铂对细胞的IC50值（1.52±0.29）μg/ml，均低于空白组（4.31±0.40）μg/ml和空载组（3.98±0.37）μg/ml，差异均有统计学意义（P＜0.05）；空白组与空载组顺铂对细胞的IC50值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表5 不同顺铂浓度人胃癌BGC823细胞存活率比较（%，±s）

表5 不同顺铂浓度人胃癌BGC823细胞存活率比较（%，±s）

注：a与空白组细胞比较，P＜0.05；b与空载组细胞比较，P＜0.05

顺铂浓度（μ g/m l）0.5 0 0 1.0 0 0 2.0 0 0 4.0 0 0 8.0 0 0空白组9 1.8 5±4.1 3 8 2.5 6±4.8 1 6 5.6 3±5.2 4 5 2.8 9±4.0 1 3 2.0 5±3.5 4空载组8 9.1 3±5.5 2 8 0.2 4±4.9 5 6 3.7 0±5.1 0 5 0.5 2±3.9 5 3 0.3 0±3.6 7转染组7 7.5 7±5.9 4 a b 6 3.3 0±5.2 9 a b 3 8.5 4±4.0 2 a b 2 1.6 9±2.5 0 a b 9.5 3±1.0 8 a b F值1 0.4 1 4 2 1.9 2 8 4 9.2 1 2 1 1 9.3 0 5 8 6.6 5 0 P值0.0 0 2 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0

2.5 PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA相对表达量的比较

各组细胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6mRNA相对表达量的组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中转染组、顺铂组、转染+顺铂组细胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相对表达量均低于空白组细胞，转染+顺铂组细胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相对表达量均低于转染组和顺铂组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；转染组和空白组细胞PI3K、MTOR、p70S6mRNA相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组细胞AKT mRNA的相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表6）

表6 各组细胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6 mRNA相对表达量的比较（±s）

表6 各组细胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6 mRNA相对表达量的比较（±s）

注：a与空白组细胞比较，P＜0.05；b与转染组细胞比较，P＜0.05；c与顺铂组细胞比较，P＜0.05

P I 3 K m R N A 0.9 1±0.1 0 0.5 5±0.0 9 a 0.5 7±0.0 8 a 0.2 9±0.0 5 a b c 4 7.9 0 1 0.0 0 0 0.8 2±0.0 8 0.8 0±0.0 7 0.8 1±0.0 9 0.7 9±0.1 0 0.1 1 3 0.9 5 1 0.8 6±0.0 8 0.5 1±0.0 7 a 0.5 6±0.0 9 a 0.2 9±0.0 5 a b c 5 0.3 2 0 0.0 0 0 0.8 4±0.0 9 0.5 6±0.0 7 a 0.5 9±0.0 6 a 0.2 7±0.0 4 a b c 5 9.8 1 7 0.0 0 0空白组转染组顺铂组转染+顺铂组F值P值A K T m R N A M T O R m R N A p 7 0 S 6 m R N A组别

2.6 PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相对表达量的比较

各组细胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相对表达量的组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中转染组、顺铂组、转染+顺铂组细胞PI3K、MTOR、p70S6的相对表达量和pAKT/AKT均低于空白组细胞，转染+顺铂组细胞PI3K、MTOR、p70S6的相对表达量和pAKT/AKT均低于转染组和顺铂组细胞，差异均有统计学意义（P＜0.05）；转染组和空白组细胞PI3K、MTOR、p70S6的相对表达量和pAKT/AKT比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表7）

表7 各组细胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相对表达量的比较（±s）

表7 各组细胞PI3K、AKT、MTOR、p70S6蛋白相对表达量的比较（±s）

注：a与空白组细胞比较，P＜0.05；b与转染组细胞比较，P＜0.05；c与顺铂组细胞比较，P＜0.05

组别空白组转染组顺铂组转染+顺铂组F值P值P I 3 K 0.8 9±0.1 2 0.5 3±0.0 8 a 0.5 9±0.0 7 a 0.2 7±0.0 4 a b c 4 7.4 7 3 0.0 0 0 p A K T/A K T 1.0 4±0.1 2 0.7 9±0.0 8 a 0.8 2±0.0 9 a 0.2 8±0.0 4 a b c 6 7.8 2 0 0.0 0 0 M T O R 0.8 5±0.0 9 0.4 8±0.0 7 a 0.5 1±0.0 8 a 0.2 4±0.0 4 a b c 6 0.0 0 0 0.0 0 0 p 7 0 S 6 0.8 2±0.1 0 0.4 9±0.0 9 a 0.5 5±0.0 8 a 0.2 5±0.0 5 a b c 4 0.6 1 1 0.0 0 0

3 讨论

胃癌是多基因、多因素综合作用导致的恶性肿瘤，环境、遗传、生活习惯及幽门螺杆菌感染等均是其危险因素[8]。由于该病早期症状隐匿且缺乏特异性，多数患者在确诊时已处于中晚期，仅能采用以化疗为主的保守治疗手段。顺铂是直接作用于DNA的铂类化疗药，已被广泛应用在胃癌的治疗中，可延长患者生存期，但由于易发生耐药，整体疗效不佳。目前，细胞耐药的相关机制并未明确，有学者认为，可能与细胞增殖及凋亡失衡相关[9]，且是多基因、多种调控机制联合作用的结果。刘蒙等[10]研究显示，下调CDH10的表达可抑制顺铂耐药细胞的增殖能力，增强胃癌细胞对顺铂的敏感性。PCDH10与肝肠钙黏蛋白17（liver-intestinecadherin，LI-cadherin，又称 CDH17）同属钙黏蛋白超家族成员，二者生理功能相似，因此，可推测PCDH10与胃癌患者顺铂耐药相关，探讨其对顺铂的敏感性及相关机制对逆转胃癌细胞耐药、改善预后至关重要。

PCDH10主要表达于中枢神经系统，在细胞内信号传导、细胞间黏附中发挥重要作用。有报道证实[11-12]，PCDH10基因启动子区的CpG岛异常甲基化，可破坏细胞信号转导通路，促使细胞向恶性转化发生癌变，且该机制在多种恶性肿瘤中均存在。田浩等[13]研究显示，胃癌组织中PCDH10蛋白相对表达量明显低于癌旁组织，且其表达水平与胃癌TNM分期、淋巴结转移及远期预后关系密切。本研究通过建立过表达PCDH10的人胃癌BGC823细胞，结果发现，稳定转染各组细胞重新接种，转染组培养24、48、72 h时的OD值、培养24 h时的迁移率和穿膜细胞数均降低，表明过表达PCDH10可降低胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力，与Ye等[14]关于PCDH10在肝癌细胞中作用机制的研究结果相似。近年来，临床对肿瘤迁移侵袭与化疗多药耐药间的研究逐渐深入，有学者认为，肿瘤细胞在产生耐药性的同时，迁移侵袭相关信号通路被激活，导致细胞迁移侵袭能力增强[15]。由此可见，肿瘤转移与耐药性的产生可能并非孤立事件，二者在功能上存在某种联系。本研究结果显示，不同顺铂浓度下，转染组细胞存活率、顺铂对细胞的IC50值均低于空白组和空载组细胞，表明过表达PCDH10可增强细胞对顺铂的敏感性。

PI3K为蛋白激酶家族成员，AKT为其下游直接效应蛋白。细胞表面的PI3K被胞外刺激信号激活后，AKT位点被磷酸化，磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，pAKT）进入细胞中，开启转导PI3K始动生物信息功能，激活下游效应基因，启动炎性反应。研究显示，多种恶性肿瘤中普遍存在PI3K/AKT信号通路的活化[16-17]，广泛参与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭等过程。李沐涵等[18]使用PI3K/AKT通路抑制剂阻断该通路后，胃癌MGC-803细胞的侵袭能力明显受抑制。MTOR为高度保守进化的丝/苏氨酸蛋白激酶，可调控细胞分裂与合成代谢，与PI3K/AKT通路密切相关[19]，可直接被AKT激活或接收生长因子信号而活化，进一步激活下游蛋白p70S6，进而加快肌动蛋白细丝重构与mRNA的翻译过程，调控蛋白生成，促进细胞增殖。付汉东等[20]研究显示，MTOR、p70S6在胃癌组织中呈异常高表达状态，且与疾病临床与病理特征相关。本研究中，人胃癌BGC823细胞经PCDH10转染及顺铂干预后，PI3K、MTOR、p70S6mRNA的相对表达量均下调，且PI3K、MTOR、p70S6蛋白的相对表达量及pAKT/AKT均降低，且转染+顺铂对其表达调控作用更加显著，表明过表达PCDH10增强细胞顺铂敏感性的机制可能与下调PI3K、MTOR、p70S6mRNA及PI3K、MTOR、p70S6蛋白表达、抑制AKT磷酸化相关，推测PCDH10可作为临床增强胃癌细胞顺铂敏感性的靶向基因。

综上所述，PCDH10过表达可抑制人胃癌BGC823细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并可增强细胞顺铂化疗敏感性，其作用机制可能与下调PI3K、MTOR、p70S6mRNA 及 PI3K、MTOR、p70S6蛋白表达、抑制AKT磷酸化相关。本研究为临床进一步明确PCDH10信号通路在胃癌多药耐药中的作用机制、逆转胃癌耐药提供了理论依据。