梅毒患者外周血程序性死亡分子1的表达水平及临床价值研究

林 洁，李东纯，林毓岑，余进胜，罗世荣

广东省惠州市惠东县人民医院检验科，广东惠州 516300

梅毒系苍白密螺旋体苍白亚种引起的性传播性疾病，临床表现多样，虽病程发展相对较慢，但可导致皮肤黏膜、心血管、神经、骨骼等多系统病变，不仅损害患者自身身心健康，而且危及下一代健康[1]。相关流行病学报道，我国梅毒发病率自2000年的6.43/10万增长至2013年的32.86/10万，年均增长率达13.37%，已成为重要的公共卫生问题[2]。程序性死亡分子1(PD-1)属CD28超家族成员，主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞表面，PD-1及其配体PD-L1或PD-L2相互作用，如与PD-L1结合后通过受体分子胞质尾部的酪氨酸激酶抑制基序激发抑制信号，从而介导负性调控[3-4]。但当前PD-1的临床研究多侧重于肿瘤疾病，甚至有以PD-1/PD-L1为治疗靶点的抗肿瘤药物，并取得一定治疗效果[5]。本研究以本院收治的60例梅毒患者为研究对象，对其外周血PD-1水平及临床意义进行分析，旨在为梅毒的临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018 年6 月至 2019 年 6 月在本院就诊的60例梅毒患者为研究对象(梅毒组)。纳入标准：(1)符合《中华人民共和国卫生行业标准WS273-2007》梅毒诊断要求；(2)患者知晓研究内容并签署研究知情同意书。排除标准：(1)合并梅毒以外的其他内外科疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病；(2)既往使用抗菌药物、激素或免疫调节剂；(3)梅毒病程<2年；治疗及随访期间有不洁性生活。梅毒患者男33例，女27例；年龄22～61岁，平均(49.24±12.33)岁；<40岁27例，40～60岁20例，>60岁13例；梅毒快速血浆反应试验(RPR)滴度1∶1 13例，1∶2 15例，1∶4 21例，1∶8 11例；临床分期Ⅰ期19例，Ⅱ期41例。另选取本院同期30例体检健康志愿者作为对照组，其中男15例，女15例；年龄25～64岁，平均(20.27±12.01)岁。2组研究对象性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1仪器与试剂 PD-1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海瓦兰生物科技有限公司；酶标分析仪为Rayto RT-2100C型，流式细胞仪为CYTOMICS FC 500型，均购自美国Beckman Coulter公司；PE鼠抗人PD-1单克隆抗体购自美国BD公司；RPMI1640培养液购自美国Gibco公司；佛波酯、离子酶素购自美国Sigma公司。

1.2.2外周血PD-1水平检测 采集研究对象晨间空腹静脉血标本，乙二胺四乙酸抗凝，3 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min分离血浆，ELISA检测外周血血浆中可溶性PD-1水平。

1.2.3流式细胞术检测细胞比例 采用流式细胞术检测外周血CD4+CD25+hight调节性T细胞(Treg)、CD4+CD25+lowTreg、CD4+CD25+lowTreg/CD4+CD25+hightTreg及其细胞上的PD-1水平。使用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMC)，10%胎牛血清的RPMI1640培养液重悬调整细胞水平至(2.0～6.0)×107/mL，RPMI1640培养液1∶1体积稀释肝素钠抗凝的全血标本，滴加佛波酯、离子酶素充分混匀，终水平分别为10 μg/L、1 mg/L，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养4 h，用于PD-1分子检测。另取刺激后的肝素钠抗凝全血标本50 μL，分别滴加FITC-CD4/APC-CD25+、PE鼠抗人PD-1单克隆抗体，充分混匀后4 ℃下避光孵育30 min，加1.7% NH4Cl溶血剂混匀，室温静置5～10 min至溶血完全，1 500 r/min条件下离心5 min，弃上清液，PBS洗涤，300 μL PBS液重悬，FACSCanto检测，CYTOMICS FC500型流式细胞仪及配套分析数据，以CD4+T淋巴细胞设门读数。

1.3观察指标 (1)比较梅毒组、对照组外周血PD-1水平；(2)比较不同性别、年龄、RPR滴度、临床分期的梅毒患者外周血PD-1水平；(3)分析梅毒患者外周血PD-1与临床特征的相关性。

2 结 果

2.12组外周血PD-1水平比较 梅毒组外周血PD-1水平显著高于对照组[(56.09±8.13)pg/mLvs.(11.20±4.50)pg/mL]，差异有统计学意义(t=-3.212,P=0.001)。

2.2不同临床特征的梅毒患者外周血PD-1水平比较 不同性别、年龄的梅毒患者外周血PD-1水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)；但RPR滴度为1∶8患者外周血PD-1水平显著高于1∶1、1∶2、1∶4患者，临床分期Ⅱ期患者外周血PD-1水平显著高于Ⅰ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床特征的梅毒患者外周血PD-1水平比较

2.3梅毒患者外周血PD-1与RPR滴度、临床分期的相关性分析 Spearman相关性分析结果显示，外周血PD-1与RPR滴度、临床分期呈正相关(r=0.659、0.433，P<0.01)。见图1。

注：A表示外周血PD-1与临床分期的相关性分析，B表示外周血PD-1与RPR滴度的相关性分析。

2.42组外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg细胞比较 2组CD4+CD25+lowTreg细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但梅毒组外周血CD4+CD25+hightTreg细胞显著高于对照组，CD4+CD25+lowTreg/CD4+CD25+hightTreg显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 2组外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg细胞比较

2.52组外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg细胞上的表达 梅毒组外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg细胞上的表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 2组外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg细胞上的表达

3 讨 论

研究指出，PD-1及其配体PD-L1信号通路在帮助机体形成自身免疫耐受的同时，也被慢性感染病毒利用，通过这一通路削弱机体抗感染免疫，促进病毒的持续感染[6]。肖健等[7]报道，HIV感染患者CD8+T细胞PD-1存在过表达现象，不仅与病毒载量呈正相关，且体内阻断PD-1/PD-L1通路或可发挥CD8+T细胞功能，认为基于该信号通路或可为临床治疗HIV感染提供理论指导。梅毒同为慢性病毒感染性疾病，但笔者查阅文献未见PD-1在梅毒患者中的表达的报道。本研究结果显示，梅毒组外周血PD-1水平显著高于对照组，且虽不同性别、年龄的梅毒患者外周血PD-1水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但RPR滴度为1∶8患者外周血PD-1水平显著高于1∶1、1∶2、1∶4患者，临床分期Ⅱ期患者外周血PD-1水平显著高于Ⅰ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)。Spearman相关性分析结果显示，外周血PD-1与RPR滴度、临床分期呈正相关。

既往研究报道，在病毒性感染疾病中，持续的病毒刺激可导致免疫损伤[8-9]。CD4+CD25+Treg细胞不仅可纠正持续病毒复制引起的免疫系统过度激活，也能抑制抵抗病毒复制的特异性免疫应答，发挥“双刃剑”的作用[10-11]。其中CD4+CD25+hightTreg作为高表达的CD4+Treg主要发挥抑制活性，可抑制自身反应性T细胞的增殖活化，其数量或功能的缺失与自身免疫性疾病的免疫平衡紊乱、疾病发生、发展密切相关[12-13]。在慢性病毒感染性疾病中，为进一步明确梅毒患者外周血PD-1的表达，本研究分析梅毒患者外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg细胞及细胞表面PD-1的表达。结果显示，梅毒组与对照组CD4+CD25+lowTreg细胞比较，差异无统计学意义(P>0.05)，但梅毒组外周血CD4+CD25+hightTreg细胞显著高于对照组，CD4+CD25+lowTreg/CD4+CD25+hightTreg显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),这与张明海等[14]的报道结论相似。且梅毒患者外周血PD-1+/CD4+CD25+hightTreg、PD-1+/CD4+CD25+lowTreg细胞上的表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。由此可见，梅毒患者不仅外周血PD-1水平存在高表达现象，外周血CD4+CD25+hightTreg、CD4+CD25+lowTreg细胞及细胞表面PD-1也存在过度表达现象。

本研究也存在一定的局限性，除标本数量相对较少外，受标本采集时间影响，本研究未能进一步分析梅毒血浆固定患者外周血PD-1、CD4+CD25+Treg细胞及细胞表面PD-1的表达情况。另外，梅毒感染引起PD-1表达上调的确切机制、PD-1对CD4+CD25+Treg细胞的免疫调控机制等，或两者间的相互协调机制等仍未明确，笔者拟在下阶段工作中持续深入探究。

综上所述，梅毒患者不仅外周血PD-1存在过表达现象，与RPR滴度、临床分期呈正相关，且CD4+CD25+Treg细胞及细胞表面PD-1也存在过表达现象，但基于本研究局限性，其具体机制仍有待持续探究。