线性探针技术诊断耐多药结核病的临床应用价值研究*

班立芳，刘建民，孔庆飞△，马海鸣，王彦淇，李 峰，李小龙

河南省郑州市第六人民医院：1.检验科；2.结核病科；3.感染管理科，河南郑州 450015

结核病是一种慢性感染性疾病，患者只要按治疗原则进行服药，绝大多数都能够治愈。若患者没有坚持早期、正规、合理的治疗，很可能导致耐多药现象的发生，使疾病的治愈变得十分困难，增加社会和家庭的经济负担，严重者甚至危及其生命。耐多药结核病已成为结核病防治工作面临的重点难题[1]，耐多药结核病的诊断目前仍采用药敏试验，虽然诊断结果准确，但是检测所需时间较长，难以满足临床早期诊断和治疗的需要。随着分子诊断技术的快速发展，线性探针技术通过检测多位点基因突变，可快速确定结核菌株的耐药性[2-3]。本研究通过比较药敏试验与线性探针技术对耐多药结核病的诊断结果，探讨线性探针技术的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年1月至2019年2月在本院就诊的247例涂阳结核病患者为研究对象，均签署知情同意书，其中男134例，女113例，年龄19～77岁，平均(44.29±7.56)岁。该研究通过本院医学伦理委员会审批。

1.2仪器与试剂 PCR核酸扩增仪(美国赛默飞ABI Veriti)。线性探针测试仪(GT Blot 48全自动杂交仪)与配套试剂(法国生物梅里埃)，结核分枝杆菌及耐药基因检测试剂盒(PCR-线性杂交酶显色法，Geno Type MTBDRplus。批号IS00173，效期2018年4月；批号IS00176，效期2018年7月；批号IS00181，效期2019年2月；批号IS00186，效期2019年7月)。分枝杆菌改良罗氏基础(酸性)培养基(河南赛诺特生物。批号20170118，效期20170717；批号20170926，效期20180325；批号20180226，效期20180825；批号20181119，效期20190518)。结核分枝杆菌药敏培养基(珠海贝索生物。批号20170116，效期20180115；批号20170613，效期20180612；批号20171219，效期20181218；批号20180509，效期2019 00508；批号2018 1023，效期20191022)。

1.3检测方法 所有研究对象均采集晨起痰标本，立即放入4 ℃冰箱(上海澳柯玛YC-1006医用冷藏箱)内保存，3 d内依次完成药敏试验检测和线性探针技术检测。(1)药敏试验检测[4]。用无菌吸管吸取1～2 mL痰标本转移至前处理管，使用2倍的4% NaOH溶液对痰标本进行稀释处理，漩涡震荡(江苏新康XK96-A震荡器)30～60 s使标本完全液化，接种至改良罗氏基础(酸性)培养基斜面中，然后放置于37 ℃恒温箱(北京森信DRP-9802电热恒温培养箱)培养2～3周。使用接种环在培养基上刮取一环菌落，置入含有1～2滴10%吐温-80的磨菌瓶中，研磨后以标准麦氏管(McFar Land)作为参照，使用BIOHIT精确移液器制成 1 g/L的菌悬液，然后加入无菌生理盐水稀释成10-2g/L和10-4g/L的菌悬液，使用22号标准接种环分别沾取一满环(0.01 mL)的菌液，采用划线法分别接种到含异烟肼、利福平的药敏试验培养基及对照培养基中，放置于37 ℃恒温箱(常州菲普DNP-250恒温培养箱)培养6周，根据药敏培养基与对照培养基菌落数的比值判断耐药结果。该药敏试验以河南省疾病预防控制中心下发的结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv敏感株)10-3mg作为室内质控。(2)线性探针技术[5]。采用超声破碎法(上海仁度FZP-1型核酸提取仪)提取痰标本DNA，取5 μL DNA标本加入至45 μL PCR扩增体系中，混合后放置于PCR核酸扩增仪中进行扩增，具体反应条件如下：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 2 min，10个循环；95 ℃ 25 s，53 ℃ 40 s，70 ℃ 40 s，30个循环；70 ℃ 10 min。PCR扩增后，根据GenoType MTBDRplus试剂盒说明书，取20 μL扩增产物进行变性裂解，再与探针试纸杂交(GT Blot 48杂交仪)，观察试纸条带显色情况，对耐药情况进行判断。判读标准：所有野生型位点显色和所有突变位点不显色为敏感，任一野生型位点不显色或任一突变位点显色为耐药。以药敏试验检测结果作为耐多药结核病诊断的“金标准”。

1.4统计学处理 所有数据采用SPSS23.0软件包进行统计学分析。计数资料以率表示，采用χ2检验对2种检测方法进行比较，检验水准(α)=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。应用灵敏度、特异度、准确性和约登指数评价2种检测方法的诊断价值。

2 结 果

2.12种方法对异烟肼耐药性的检测结果 线性探针技术对异烟肼耐药性的检出率为21.46%(53/247)，药敏试验的检出率为21.86%(54/247)，2种方法对异烟肼耐药性的检出率比较，差异无统计学意义(χ2=0.012，P>0.05)，见表1。线性探针技术对异烟肼耐药性检测的灵敏度为88.89%，特异度为97.41%，准确性为95.55%，约登指数为0.863。

2.22种方法对利福平耐药性的检测结果 线性探针技术对利福平耐药性的检出率为24.29%(60/247)，药敏试验的检出率为24.70%(61/247)，2种方法对利福平耐药性的检出率比较，差异无统计学意义(χ2=0.011，P>0.05)，见表1。线性探针技术对利福平耐药性检测的灵敏度为88.52%，特异度为96.77%，准确性为94.74%，约登指数为0.853。

2.32种方法对耐多药结核病的检测结果 线性探针技术对耐多药结核病的检出率为20.24%(50/247)，药敏试验的检出率为21.05%(52/247)，2种方法对耐多药结核病的检出率比较，差异无统计学意义(χ2=0.049，P>0.05)，见表1。线性探针技术对耐多药结核病检测的灵敏度为84.62%，特异度为96.92%，准确性为94.33%，约登指数为0.815。

表1 2种方法对结核病耐药性的检测结果分析(n)

3 讨 论

耐多药结核病是指结核分枝杆菌至少对异烟肼、利福平2种抗结核药物产生耐药性，其发生与药物使用不规范、初始耐药、人口流动性、治疗管理不善等多种因素有关，我国耐多药结核病患者人数逐年增加，已成为该疾病的高负担国家之一[6]。耐多药结核病的治疗十分困难，治疗成本较高，因此，快速准确地对结核分枝杆菌耐药性进行检测，以便制订合理、有效的治疗方案，有助于提高疾病的治疗效果，并降低耐药菌传播的风险[7]。传统药敏试验是耐多药结核病诊断的“金标准”，但是该方法检测所需时间长，时效性较差，在一定程度上限制了其临床应用。线性探针技术是利用多重PCR扩增反应原理，针对异烟肼和利福平耐药常见基因突变位点而设计探针，是一种快速的分子生物学诊断方法，有利于结核病耐药情况的早期筛查和诊断，目前已在很多地区得到推广应用[8-10]。

本研究发现，线性探针技术对异烟肼耐药性(21.46%)、利福平耐药性(24.29%)及耐多药结核病(20.24%)的检出率与药敏试验差异无统计学意义(P>0.05)，并且线性探针技术对异烟肼耐药性、利福平耐药性及耐多药结核病检测的灵敏度、特异度、准确性及约登指数也均较高，这与以往研究结果一致[11-12]，说明线性探针技术在耐多药结核病的早期诊断方面具有较好的临床应用价值，为疾病的及时、有效治疗提供保障。

综上所述，线性探针技术作为一种辅助诊断技术，对耐多药结核病检测的灵敏度、特异度及准确性均较高，能准确、快速诊断结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的耐药性及多药耐药性，与传统的药敏试验检测结果具有高度的一致性，对于耐多药结核病的早期诊断具有重要意义。