胆维丁乳对急性肺损伤小鼠肺表面活性物质的影响

李野，李斌超，张雅琳，刘宁，刘祖望，孔娟

（中国医科大学附属盛京医院临床营养科，沈阳 110004）

急性肺损伤 （acute lung injury，ALI） 是肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞受损的急性肺部炎症综合征 （acute respiratory distress syndrome，ARDS）［1］，是一种高死亡率的急危重症。通过气管滴注脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）可建立ALI 小鼠模型［2］。

肺表面活性物质由Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌，主要成分为二棕榈酰卵磷脂和肺表面活性物质结合蛋白 （surfactant protein，SP），分布于肺泡液体分子层表面，能降低肺泡表面张力，维持大小肺泡容量的相对稳定［3］，阻止肺泡毛细血管中液体向肺泡内滤出，是治疗ALI的有效手段［4］。目前已知的SP有SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 4种。维生素D是一种脂溶性类固醇激素，在钙磷平衡和骨代谢中起重要作用［5-7］，并可通过其受体 （vitamin D receptor，VDR） 调控多种生理反应［2，8-16］。研究［17-19］发现，维生素D3能调节Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖。胆维丁乳 （cholecalciterol cholesterol emulsion，CCE） 是一种新型的活性维生素D前体，临床上常用于治疗婴幼儿维生素D缺乏性佝偻病。SP在维生素D缺乏小鼠的肺中表达减少［20］。本研究拟探讨CCE对LPS所致ALI肺表面活性物质的影响。

1 材料与方法

1.1 制作动物模型与分组

将36只健康雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组、CCE组、LPS组、LPS+CCE组，每组9只。正常对照组和LPS组给予饮用水，CCE组和LPS+CCE组小鼠给予10%CCE水溶液 （避光，购自中国医科大学附属盛京医院）。饲喂14 d后，LPS 组和LPS+CCE组小鼠行气管切开，滴注LPS （10 mg/kg），24 h后取血清、肺泡灌洗液及肺组织备用。

1.2 检测血清钙、磷的含量

从小鼠心脏取血，分离血清，采用钙测试盒 （带标准） 微板法 （C004-2，南京建成生物工程研究所）、无机磷测试盒 （C006-1，南京建成生物工程研究所）检测各组小鼠血清钙、磷含量。

1.3 测定小鼠肺组织湿/干质量比

取4组小鼠的右下肺，用吸水纸吸干肺组织表面血迹，立即称质量，记为“湿质量”。置于80 ℃恒温干燥箱内烘干，48 h后称质量，记为“干质量”。计算肺湿/干质量比。

1.4 肺组织HE染色

4%多聚甲醛固定肺组织，石蜡包埋并切片，脱蜡，HE染色，封片，光镜下观察并拍照。

1.5 实时PCR

用TRIzol试剂盒 （美国Invitrogen公司） 提取肺组织总RNA，按照产品说明书操作。用生物分光光度计测定RNA浓度和纯度。取2 μg RNA样本，用TaKaRa逆转录试剂盒 （A2302-1，日本TaKaRa公司）进行逆转录合成cDNA，并以此为模板进行PCR扩增反应。逆转录和PCR反应条件按照试剂盒说明书设置。引物由上海生工生物工程公司合成，见表1。

1.6 Western blotting

取肺组织，研磨匀浆后，蛋白裂解，BCA法检测总蛋白浓度。取50 μg总蛋白，行SDS-PAGE电泳，电转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h。加入一抗（VDR抗体 1：1 000稀释，购自美国SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司；GAPDH抗体 1 ∶5 000稀释，购自美国Proteintech公司），4 ℃孵育过夜。TBST洗3次，室温孵育二抗1 h，ECL显色。Image J图像分析软件对条带进行定量分析比较。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequence

1.7 绘制生存曲线

另取健康雄性BALB/c小鼠20只，分为LPS组、LPS+CCE组，每组10只，处置同1.1，绘制并分析2组小鼠生存时间曲线。

1.8 统计学分析

采用Graph Pad Prism 5.0软件进行统计学分析，计量结果均采用表示，采用方差分析或配对t检验进行组间比较。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCE对ALI模型小鼠血清钙、磷含量的影响

如表2所示，喂饲CCE 2周后，4组小鼠血清钙、磷水平无统计学差异。说明CCE对LPS所致ALI模型小鼠血清钙、磷的影响较小，故可排除血清钙、磷水平的高低对实验结果的干扰。

2.2 CCE对ALI模型小鼠生存时间的影响

如图1所示，LPS+CCE组小鼠平均生存时间长于LPS组，小鼠死亡的首发时间晚于LPS组，给予LPS处理后25 h，LPS+CCE组小鼠仍有80%存活，LPS组则有40%小鼠死亡；53 h以内LPS组小鼠全部死亡，2组小鼠生存时间有显著的统计学差异 （P< 0.05）。表明CCE能显著延长ALI小鼠的生存时间，对ALI起保护作用。

2.3 CCE对ALI模型小鼠肺组织及肺水肿的影响

肉眼观察可见，与正常对照组相比，LPS组小鼠双肺肿胀，体积变大，肺表面可见出血区。光镜下（图2A） 可见，正常对照组与CCE组小鼠肺泡结构完整，肺泡腔和间隙内无炎症细胞浸润；LPS组小鼠肺泡和肺间质广泛充血、水肿、大量炎性渗出液，肺泡腔可见破裂的红细胞和渗出物，肺泡结构紊乱，肺泡腔狭窄，肺泡间隔增厚；与LPS组相比，LPS+CCE组小鼠肺泡和肺间质微血管充血扩张程度及炎症细胞浸润减轻，肺泡腔内红细胞减少。

表2 4组小鼠血清钙、磷含量 （，n=9）Tab.2 Serum calcium and phosphorus contents in 4 groups （，n=9）

表2 4组小鼠血清钙、磷含量 （，n=9）Tab.2 Serum calcium and phosphorus contents in 4 groups （，n=9）

CCE，cholecalciterol cholesterol emulsion；LPS，lipopolysaccharides.

图1 Kaplan-Meier法测定LPS诱导的ALI小鼠生存曲线 （n=10）Fig.1 The survival curve of ALI mice induced by LPS determined by Kaplan-Meier method （n=10）

为了观察ALI时肺泡和肺间质充血、水肿的程度，本研究进一步检测了肺湿/干质量比。结果如图2B所示，LPS组小鼠肺湿/干质量高于正常对照组，差异有统计学意义 （P< 0.01）；LPS+CCE组较LPS组显著降低，差异有统计学意义 （P=0.023）。提示CCE能改善ALI肺组织水肿程度。

2.4 CCE对ALI模型小鼠肺中VDR表达的影响

图2 CCE对ALI小鼠肺组织病理变化及水肿程度的影响Fig.2 The effect of CCE on the pathological changes of lung tissue and the degree of edema in ALI mice

Western blotting和实时PCR结果如图3所示，CCE 组小鼠肺组织中VDR蛋白表达水平高于正常对照组，LPS+CCE组VDR蛋白表达水平高于LPS组，差异有统计学意义 （P=0.012，P=0.005）。提示饲喂CCE能增加小鼠肺组织内VDR表达。

2.5 CCE对ALI模型小鼠肺组织SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表达的影响

如表3所示，CCE小鼠肺组织SP-A、SP-C和SP-D的表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P=0.007，P=0.011，P=0.006）；与正常对照组相比，LPS组SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表达水平均显著下降 （P=0.006，P=0.016，P=0.001，P=0.001），而LPS+CCE组SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表达水平均较LPS组显著上升 （P=0.001，P=0.049，P=0.001，P=0.042），差异有统计学意义。表明CCE能促进小鼠肺泡中肺表面活性物质的产生。

3 讨论

尽管临床研究［21-22］发现，活性维生素D可影响血清钙磷水平，但本研究结果显示CCE并未影响小鼠的血清钙磷水平，因此排除了血清钙磷对后续实验结果的影响。

图3 小鼠肺组织VDR蛋白及mRNA表达情况Fig.3 Expression of VDR protein and mRNA in the lungs of mice

表3 各组小鼠肺中SP-A、SP-B、SP-C、SP-D mRNA表达水平比较 （n=9）Tab.3 Comparison of the mRNA expression levels of SP-A，SP-B，SP-C and SP-D in the lungs of mice in each group （n=9）

本研究发现，LPS+CCE组小鼠死亡首发时间晚于LPS组，且平均生存时间长于LPS组，提示维生素D前体CCE有显著延长ALI小鼠生存时间的作用，原因可能与维生素D的抗炎特性有关［23-24］。本研究还发现，CCE具有减轻ALI所致肺组织损伤的作用。HE染色显示，LPS组小鼠肺组织可见肺泡上皮细胞及间质水肿、肺泡腔内渗出、充血、炎症细胞浸润等典型ALI病理改变［25］，而LPS+CCE组ALI病理改变较LPS组减轻。小鼠肺湿/干质量比能反映ALI所致肺水肿的程度，ALI时肺水肿严重，肺湿/干质量比升高［26］。本研究结果显示，LPS+CCE组肺湿/干质量比较LPS组降低，提示CCE在一定程度上缓解了LPS对小鼠造成的ALI肺水肿。

本研究发现，与正常对照组和LPS组相比，CCE组和LPS+CCE组小鼠肺组织内VDR表达水平显著升高，表明饲喂CCE能使小鼠体内VDR表达增多。研究［27-29］表明，ALI会造成肺泡不稳定、肺泡去复张及相应的组织重塑，肺表面活性物质可降低肺泡表面张力，从而防止低肺容量时发生肺泡塌陷及水肿［30-31］，因此增加肺表面活性物质可治疗ALI［4］。维生素D3可加速胎儿肺成熟和Ⅱ型肺泡上皮细胞分化，并增加大鼠肺组织和Ⅱ型肺泡上皮细胞中肺表面活性物质的表达和分泌［32-34］。有研究［35］表明，维生素D3可直接作用于原代培养的Ⅱ型肺泡上皮细胞，诱导SP-BmRNA的产生，故推测维生素D前体CCE对ALI的保护作用有可能是因为增加了肺表面活性物质，因此本研究检测了各组小鼠肺组织中SP-A、SP-B、SP-C、SP-D的表达情况，结果证实CCE确能增加SP的表达。

综上所述，本研究证实了维生素D前体物质CCE能缓解LPS造成的ALI，改善并延长ALI小鼠的生存时间，改善肺组织病理学变化及肺水肿，增加SP的表达。因此，维生素D前体CCE增加肺表面活性物质可能是缓解ALI的机制之一，为探索ALI治疗方法提供了新的思路。