圣约翰草提取物对慢性不可预知性应激致小鼠抑郁模型的影响

傅松年，王江涛，罗福祥，曾贵荣，李治建，马丽

（1.新疆医科大学第一附属医院心理医学中心，乌鲁木齐 830011；2.新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所毒理学研究室，乌鲁木齐 803349；3.新药药效与安全性评价湖南省重点实验室，长沙 410331）

圣约翰草，中药名贯叶金丝桃，为藤黄科植物贯叶金丝桃的干燥地上部分。辛，寒。归肝经，具有疏肝解郁，清热利湿，消肿通乳的功效。用于肝气郁结，情志不畅，心胸郁闷，关节肿痛，乳痈，乳少［1］。圣约翰草中含有抗抑郁成份贯叶金丝桃素、金丝桃素、伪金丝桃素和金丝桃苷等。目前，圣约翰草提取物在临床上被广泛应用于治疗轻中度抑郁障碍，疗效显著［2］，并已获得国内外指南的一致推荐［3］。本研究采用慢性不可预知性温和应激法建立小鼠抑郁模型，采用自主活动悬尾行为学测试检测血清中5-羟色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲肾上腺素 （noradrenaline，NE） 的水平及脑海马区病理学检查，探讨圣约翰草提取物对抑郁模型小鼠抗抑郁的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性ICR小鼠70只，体质量18.0～22.0 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK （湘） 2016-0002。饲养于新疆维吾尔医药研究所SPF级实验室中，饲养温度20～26 ℃，湿度40%～70%，实验动物使用许可证号：SCXK （新）2018-0001。

1.2 药物及试剂

圣约翰草提取物，规格：每片质量0.56 g，含圣约翰草 （贯叶金丝桃） 提取物306 mg，批号0070417，有效期至2020年1月。盐酸氟西汀分散片，规格：20 mg （以氟西汀计），批号7339A，分包装批号7339AA，有效期至2019年8月。购自礼来苏州制药有限公司。

1.3 主要仪器

AX4201ZH/E型电子天平［奥豪斯仪器 （常州）有限公司，ME2002E型电子天平，BEHAV动物行为机能系统 （上海吉量科技有限公司），小动物悬尾测试仪 （成都泰盟科技技术有限公司产品），TDL-5-A型低速大容量离心机 （上海安亭科学仪器厂），MULTISKAN FC酶标仪 （美国Thermo公司），TP1020生物组织自动脱水机 （德国莱卡公司），KD-BM/BLⅡ生物组织自动包埋机 （浙江金华科迪仪器设备有限公司），RM2235切片机 （德国莱卡公司），KD-T电脑生物组织摊烤片机 （浙江金华科迪仪器设备有限公司），DM4000型光学显微镜 （德国莱卡公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 慢性不可预知性温和应激法致小鼠抑郁模型的建立：雄性ICR小鼠70只，体质量18.0～22.0 g，除正常对照组外，其余小鼠采用慢性不可预知性温和应激法制备小鼠抑郁模型。实验过程中采用禁食、禁水 （12 h）、昼夜颠倒 （12 h/12 h），强迫游泳 （10 min）、噪声 （30 min）、频闪 （12 h）、动物束缚 （12 h） （置于50 mL离心管内，管直径为3.0 cm，长约10 cm，管壁有6～7个直径为0.5 mm的通风口，束缚期间动物禁食禁水）、湿笼 （12 h）、倾笼 （12 h），每天随机采取2～3种不同方式进行不规律刺激，连续4周。

1.4.2 分组与给药：动物连续造模4周后根据糖水偏爱检测结果将动物随机分为正常对照组、模型对照组、盐酸氟西汀组［2.6 mg/ （kg·d）］、圣约翰草提取物低、中、高剂量组［0.2 g/ （kg·d）、0.4 g/ （kg·d）、0.8 g/ （kg·d）］。正常对照组和模型对照组每天给予纯水灌胃，其余各组分别给予相应药液，给药体积为20 mL/kg，连续给药4周，除正常对照组外，各组于给药后1 h继续进行慢性不可预知性温和应激刺激。

1.4.3 糖水偏爱测试：糖水偏爱测试分为训练期和测试期。测试前2 d作为训练期，使动物充分适应蔗糖饮水，第1个24 h给予动物2瓶1%蔗糖水。第2个24 h也是训练期，给予小鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶纯水。测试前不禁食，禁水8 h。测试期，同时给予小鼠1 瓶1%蔗糖水，1瓶纯水，测试15 h内动物分别饮用糖水和纯水水量。测试中间，将2个瓶子位置互换以避免位置偏爱影响因素。测试结束，计算糖水偏爱指数 （糖水偏爱指数=糖水消耗/总液体消耗×100%）。

1.4.4 空场测试：给药结束后将动物放入测试箱中，适应3 min后开始检测，检测10 min内小鼠自发活动。

1.4.5 悬尾测试：将小鼠倒置，尾部固定于悬尾装置上，头部距桌面约5 cm，使小鼠前后左右均无攀抓的地方，小鼠间有挡板隔开视线，防止互相干扰，检测每只动物5 min的活动情况。

1.4.6 ELISA法检测小鼠血清指标：行为学检测结束后，对动物禁食，次日眼眶取血，分离血清，ELISA法检测圣约翰草提取物对小鼠血清中5-HT、NE含量的影响。

1.4.7 海马组织病理学观察：行为学测试结束后，灌流固定取海马组织，石蜡切片，染色、脱水、透明及封固后，光镜观察海马组织神经元形态并拍照。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 圣约翰草提取物对小鼠糖水偏爱的影响

与正常对照组比较，模型对照组小鼠糖水偏爱指数明显降低 （P< 0.05）。与模型对照组比较，盐酸氟西汀组，圣约翰草提取物低、中、高剂量组小鼠糖水偏爱指数显著升高 （P< 0.01）。见表1。

2.2 圣约翰草提取物对小鼠空场活动的影响

表1 圣约翰草提取物对小鼠糖水偏爱的影响 （，n=10）Tab.1 Effect of St.John’s wort extract on sugar water preference in mice （，n=10）

表1 圣约翰草提取物对小鼠糖水偏爱的影响 （，n=10）Tab.1 Effect of St.John’s wort extract on sugar water preference in mice （，n=10）

1） P < 0.05，compared with normal control group；2） P < 0.01，compared with model control group.

与正常对照组比较，模型对照组小鼠自主活动总路程、平均速度均明显减少 （P< 0.05）、活动时间显著减少 （P< 0.01），休息时间显著增加 （P< 0.01）。与模型对照组比较，圣约翰草提取物低、中、高剂量组小鼠总路程、平均速度、活动时间均明显降低（P< 0.05），休息时间显著增加 （P< 0.05或P< 0.01）。见表2。

2.3 圣约翰草提取物对小鼠悬尾活动的影响

表2 圣约翰草提取物对小鼠空场的影响 （，n=10）Tab.2 Effect of St.John’s wort extract on mice in relation to the open field test （，n=10）

1） P < 0.05，2） P < 0.01，compared with normal control group；3） P < 0.05，4） P < 0.01，compared with model control group.

与正常对照组比较，模型对照组小鼠活动静止时间显著延长 （P< 0.01）。与模型对照组比较，圣约翰草提取物低、中、高剂量组均能显著缩短静止时间 （P< 0.05或P< 0.01），且与盐酸氟西汀组作用相当。见表3。

2.4 圣约翰草提取物对小鼠血清5-HT、NE含量的影响

与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中5-HT、NE含量明显降低 （P< 0.05）。与模型对照组比较，圣约翰草中、高剂量组小鼠血清中5-HT含量明显升高 （P< 0.05） ；圣约翰草中、高剂量组小鼠血清中NE含量明显升高 （P< 0.05）。见表4。

2.5 小鼠海马锥体细胞萎缩、变性评分

与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马锥体细胞萎缩、变性，主要处于重度损害状态，且动物只数较多。与模型对照组比较，圣约翰草提取物低、中、高剂量组小鼠海马锥体细胞主要处于正常和轻度损害，且正常状态较多；圣约翰草提取物高剂量组有部分小鼠海马锥体细胞处于轻度损害；盐酸氟西汀组小鼠海马锥体细胞主要处于轻度损害，且动物只数较多。评分标准：对大脑海马损伤情况进行评分，按照海马锥体细胞萎缩、变性程度分为0分，正常；1分，轻度损害 （病变<20%） ；2分，中度损害（病变20%～40%） ；3分，重度损害 （病变>40%），见表5。

表3 圣约翰草提取物对小鼠悬尾活动的影响 （，n=10）Tab.3 Effect of St.John’s wort extract on mice in relation to the tail suspension test （，n=10）

表3 圣约翰草提取物对小鼠悬尾活动的影响 （，n=10）Tab.3 Effect of St.John’s wort extract on mice in relation to the tail suspension test （，n=10）

1） P < 0.01，compared with normal control group；2） P < 0.01，3） P < 0.05，compared with model control group.

表4 圣约翰草提取物对小鼠血清5-HT、NE含量的影响 （，n=10）Tab.4 Effect of St.John’s wort extract on the serum 5-HT and NE levels of mice （，n=10）

表4 圣约翰草提取物对小鼠血清5-HT、NE含量的影响 （，n=10）Tab.4 Effect of St.John’s wort extract on the serum 5-HT and NE levels of mice （，n=10）

1） P < 0.05，compared with normal control group；2） P < 0.05，compared with model control group.

2.6 海马组织病理学检查

与正常对照组比较，模型对照组小鼠海马组织神经元损伤程度较重，表现为海马锥体细胞排列不规则，部分神经元丢失、锥体细胞萎缩、变性及数量减少，主要处于重度损害状态 （病变>40%） ；与模型对照组比较，圣约翰草低、中、高剂量组均能逆转以上改变，可见小鼠海马组织神经元损伤程度较轻，表现为海马椎体细胞排列较为规则，细胞膜结构较完整，细胞核形态正常，主要处于正常状态，少数处于轻度损害 （病变<20%），见图1。

3 讨论

慢性不可预知性模型是目前研究抑郁模型常用疾病模型之一，该模型稳定性与重复性好，能更好地模拟人类在社会环境中面临的高压、孤独、拥挤等应激因素，因此被广泛用于抑郁症发病机制和抗抑郁药物的药理学研究［4-5］。快感缺失是抑郁症的一个典型症状，糖水偏爱实验多用于评价快感缺失的经典行为学检测实验。空场实验是经典的情绪相关行为学检测实验，用于评价动物的好奇和自我探索行为。悬尾实验检测绝望行为，是抗抑郁药物初筛以及检测模型动物是否出现“抑郁样”行为的常用检测实验［6-7］。本研究结果表明，慢性不可预知性小鼠模型动物表现出糖水偏爱指数降低、小鼠自主活动测试中的休息时间增加，悬挂测试中的不动时间增加，提示造模成功。圣约翰草提取物能明显改善慢性不可预知致小鼠行为学改变，主要表现在升高小鼠糖水偏爱指数、减少小鼠自主活动测试中的休息时间，减少悬挂测试中的不动时间。

表5 圣约翰草提取物对小鼠海马锥体细胞萎缩、变性评分的影响 （n=10）Tab.5 Effect of St.John’s wort extract on the atrophy and degeneration of the hippocampal pyramidal cells in mice （n=10）

图1 圣约翰草提取物对抑郁症模型小鼠海马组织神经元的影响 HE×200Fig.1 Effect of St.John’s wort extract on the neurons in the hippocampal tissue of depression model mice HE×200

目前临床上主要以5-HT、NE重吸收抑制剂作为抑郁症治疗的首选药物，此类药物可通过阻断5-HT或NE重吸收，提升其在突触间隙的浓度，进而有效缓解病情［8］。中枢神经递质在调节情绪、学习和记忆方面起着重要作用。慢性应激可影响单胺类神经递质含量，导致应激小鼠海马组织5-HT、NE水平降低，相关研究表明圣约翰草提取物能够均衡地抑制再摄取泵对5-HT、NE的再摄取，使此两种神经递质在突触前膜的重吸收减少。反馈性地增加神经递质的合成与释放，致其在突触间隙的浓度增加［9-11］。本研究结果表明，模型对照组小鼠海马中5-HT、NE含量等明显低于正常小鼠，圣约翰草提取物能够明显提高抑郁模型小鼠血清中5-HT、NE的水平，其结果与文献报道一致。海马体是脑组织边缘系统的重要组成部分，与情感和记忆有关，海马对调节情绪、学习和记忆、行为等起重要作用，也是应激反应的高位调节中枢。临床抑郁患者海马组织萎缩、神经元减少［12］，研究［13］表明长期慢性应激能损伤小鼠海马神经元，主要表现在海马神经元细胞减少，本研究结果显示，慢性不可预知性小鼠模型小鼠海马组织细胞排列稀疏紊乱，部分椎体出现细胞坏死，海马神经元减少，圣约翰草提取物能明显改善海马组织病理改变［14-15］。提示圣约翰草提取物可改善抑郁小鼠海马组织神经元的损伤。

综上所述，圣约翰草提取物的抗抑郁作用可能与增加调节血清中5-HT、NE浓度，减轻海马组织神经元损伤有关。